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Aug 01, 2023

Chemisch programmierter STING

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4584 (2023) Diesen Artikel zitieren 1786 Zugriffe auf 11 Altmetric Metrics-Details Die oft immunsuppressive Tumormikroumgebung (TME) kann das Immunsystem behindern

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4584 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die häufig immunsuppressive Tumormikroumgebung (TME) kann die Immunumgehung und die Reaktion auf Checkpoint-Blockade-Therapien behindern. Die pharmakologische Aktivierung des STING-Signalwegs führt zwar zu einem immunologisch heißen TME, die systemische Verabreichung könnte jedoch zu unerwünschten Entzündungsreaktionen außerhalb des Ziels führen. Hier generieren wir eine kleine Gruppe Esterase-aktivierbarer Prodrugs basierend auf der Struktur des Nicht-Nukleotid-STING-Agonisten MSA-2, die anschließend zur intravenösen Verabreichung stabil in ein liposomales Vesikel eingebaut werden. Die pharmakokinetischen Eigenschaften und die immunstimulierende Kapazität von über Liposomen (SAProsomen) abgegebenen Prodrugs sind im Vergleich zur freien Medikamentenform verbessert. Durch die Durchführung eines Wirksamkeitsscreenings zwischen den SAProsomen, die verschiedene Prodrugs in syngenen Maustumormodellen enthalten, stellen wir fest, dass eine überlegene therapeutische Leistung auf einer verbesserten Abgabe an die gewünschten Tumor- und Lymphkompartimente beruht. Der beste Kandidat, SAProsom-3, stimuliert die Sekretion entzündlicher Zytokine stark und schafft eine tumorizide Immunlandschaft. Insbesondere führt SAProsom-3 bei Anwendung auf Brustkrebs- oder Melanom-Mausmodelle zu einer dauerhaften Remission etablierter Tumoren und einem postoperativen tumorfreien Überleben, während gleichzeitig die Metastasenbelastung ohne signifikante systemische Toxizität verringert wird. Zusammenfassend stellt unsere Arbeit den Grundsatzbeweis für eine gezieltere, effizientere und sicherere STING-Agonisten-Therapie dar.

Die Krebsimmuntherapie mit Inhibitoren der Immun-Checkpoint-Blockade (ICB) (z. B. Anti-PD-1/PD-L1- und Anti-CTLA-4-Antikörper) hat bemerkenswerte klinische Erfolge erzielt und zu dauerhaften und langfristigen therapeutischen Reaktionen bei mehreren Krebsarten geführt1. Allerdings profitiert nur eine kleine Untergruppe der Patienten von dieser Behandlung2. Viele unzugängliche Tumoren sind immunologisch kalt und zeichnen sich durch die reichliche Infiltration von Immunsuppressoren aus, während sie frei von tumorinfiltrierenden Lymphozyten sind, was es ihnen ermöglicht, der Immunüberwachung zu entgehen3,4. Folglich zeigen die meisten Krebsarten eine überwältigende De-novo-Refraktärität gegenüber den von der Food and Drug Administration zugelassenen ICB-Antikörpern5,6,7. Daher wird erwartet, dass wirksame immuntherapeutische Ansätze, die über diejenigen hinausgehen, die direkt auf die adaptive Immunantwort abzielen, großen Populationen von Krebspatienten zugute kommen werden und daher dringend benötigt werden8,9,10,11.

Der Stimulator von Interferon-Genen (STING) ist ein intrazellulärer Signalrezeptor, der den angeborenen Immunweg reguliert und für die Auslösung der Antitumorimmunität von entscheidender Bedeutung ist12. Die pharmakologische Aktivierung von STING über endogene zyklische Dinukleotide (CDN), wie z. B. 2′,3′-zyklisches Guanosinmonophosphat-Adenosinmonophosphat (cGAMP), was die Induktion von Typ-I-Interferonen (IFN) und anderen proinflammatorischen Zytokinen auslöst. Dies stimuliert die Aktivierung dendritischer Zellen (DC) und die Kreuzpräsentation von Tumorantigenen weiter und kehrt die Desertifikation des Tumorimmunsystems um13,14. Erhebliche Anstrengungen wurden auf die Entwicklung von CDN-Derivaten konzentriert, die endogenes cGAMP nachahmen15,16,17. Allerdings wird die Wirksamkeit dieser Agonisten aufgrund der metabolischen Instabilität und der schnellen Clearance aus dem Körper nach systemischer Verabreichung erheblich beeinträchtigt. Die therapeutische Abgabe von CDN-basierten STING-Agonisten in das Zytosol von Zielzellen ist aufgrund der hohen Hydrophilie und negativen Ladung des Moleküls schwierig18,19. Darüber hinaus können intravenös injizierte niedermolekulare STING-Agonisten eine unkontrollierte systemische Verbreitung und weitreichende Entzündungsreaktionen hervorrufen20. Daher konzentrieren sich aktuelle klinische Studien mit CDN-basierten STING-Agonisten auf die direkte intratumorale Injektion, was ihre klinische Umsetzung auf Patienten mit zugänglichen soliden Tumoren beschränkt21,22. Die Stimulierung der Antitumorimmunität durch eine intravenöse systemische Therapie bietet jedoch einen bemerkenswerten Vorteil bei der Beseitigung chirurgisch inoperabler und insbesondere metastasierter Krebsläsionen23. Die oben genannten Herausforderungen haben die Erforschung von STING-aktivierenden Systemen zur Durchführung und raschen Ausweitung ihrer Immuntherapieversuche zur Krebsbekämpfung veranlasst. MSA-2 ist ein kürzlich entwickelter nicht-nukleotider STING-aktivierender Agonist. Dieses Mittel wurde in Tierstudien oral verabreicht, obwohl eine geringe orale Bioverfügbarkeit und ein unzureichender zytosolischer Eintritt seine Antitumorwirksamkeit einschränken könnten24. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Carboxyleinheit (10-OH) am MSA-2-Molekül für dessen schlechte Kompatibilität mit Arzneimittelträgern verantwortlich sein könnte und dass dies durch rationale chemische Derivatisierung verbessert werden könnte.

Hier entwickeln wir STING-aktivierende liposomale Vesikel, die künstlich hergestellte MSA-2-Prodrugs einschließen, um die angeborene Antitumorimmunität zu stärken (Abb. 1a–c). Die Wirkstoffaktivierungskinetik dieser Pro-Wirkstoff-Einheiten vom Morpholin-Typ (MP) ist über unterschiedliche Kohlenwasserstoffzahlen einstellbar und ermöglicht so die Auswahl von Kandidaten, die schnell Wirkstoffe für eine wirksame STING-Aktivierung freisetzen können. Wir offenbaren eine bemerkenswert robuste Struktur-Aktivitäts-Beziehung für künstlich hergestellte STING-Agonisten-Pro-Drug-Liposomen (SAProsome), die ihre Optimierung im Hinblick auf adaptive Formulierung und In-vivo-Antitumorwirksamkeit ermöglichen. Insbesondere bei der Verabreichung an dreifach negative Brustkrebs-4T1- und Melanomkrebs-B16F10-Modelle, die auf eine ICB-Therapie weitgehend refraktär sind, fördert SAProsome die Antitumorimmunität, eine dauerhafte Remission etablierter Tumoren, ein postoperatives tumorfreies Überleben und eine Hemmung der Metastasenlast. Daher unterstreicht diese Studie das Potenzial von durch liposomale Verabreichung optimierten STING-Vormedikamenten als vielversprechende Behandlungen zur Verbesserung der Antitumorimmunität.

a, b Rationales Design der von MSA-2 abgeleiteten STING-Prodrugs 1–4 über eine hydrolytische Esterbindung zur Optimierung der liposomalen In-vivo-Abgabe. Die Prodrugs wurden so konzipiert, dass sie durch Esterase hydrolysiert werden, um spontan aktives MSA-2 in den Zielzellen freizusetzen. Im Gegensatz zu freiem MSA-2 können diese Prodrugs stabil zu Lipidbestandteilen zusammengesetzt werden, um liposomale Vesikel zu bilden. c Schematische Darstellung der Esterase-responsiven Aktivierung von MSA-2 als STING-aktivierendes Molekül, gefolgt von einer Antitumor-Immunstimulation bei tumortragenden Mäusen. d Arzneimittelaktivierungskinetik der Prodrugs 1–4 in Gegenwart oder Abwesenheit von Schweineleberesterase (PLE, 50 Einheiten/ml) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37 °C. Die Daten werden als ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt, n = 3. e, f Extrapolation von Geschwindigkeitskonstanten pseudo-erster Ordnung aus den Kurven in (e), wenn die Prodrugs in PLE-haltigem PBS inkubiert wurden. Die Daten werden als ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt, n = 3. g Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Kryo-TEM-Bilder von SAProsom-3. Jedes Experiment wurde unabhängig voneinander in dreifacher Ausfertigung wiederholt, was zu ähnlichen Ergebnissen führte. h, i Stabilität von SAProsomen. Partikelgrößen (h) und Polydispersitätsindex (PDI) (i) wurden mittels dynamischer Lichtstreuungsanalyse über 72 Stunden überwacht. Die Daten werden als ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt, n = 3. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Ein kürzlich entdeckter Nicht-Nukleotid-STING-Agonist, MSA-2, wurde ausgewählt, um die Gültigkeit unseres Arzneimitteldesigns zu testen. Um die liposomale Formulierung von MSA-2 zu erleichtern, wurden zunächst vier synthetische MSA-2-Derivate (Verbindungen 1–4) über Esterbindungen unter Verwendung von MP-Typ-Alkanolen unterschiedlicher Länge als Modifikatoren konstruiert (Abb. 1a; Einzelheiten zur Synthese finden Sie in den Zusatzinformationen). ). Ihre chemischen Strukturen wurden mittels Protonenkernresonanz und hochauflösender Massenspektrometrie eindeutig bestätigt (Ergänzende Abbildungen S1 – S10). Wir haben versucht, die Polarität der Carboxylgruppe auf MSA-2 durch chemische Derivatisierung mit MP zu reduzieren, um den effizienten Zusammenbau der Prodrugs zu liposomalen Nanovesikeln zu ermöglichen. Die Esterbindung ist anfällig für eine Esterase-katalysierte Hydrolyse in Tumoren und ermöglicht dadurch die In-situ-Freisetzung chemisch nicht modifizierter Agonisten für die STING-Aktivierung25,26,27,28. Anschließend untersuchten wir die durch Esterase ausgelöste Aktivierung von MSA-2 durch die Prodrugs29. MSA-2-Prodrugs zeigten in Gegenwart von Schweineleberesterase (PLE) eine einstellbare und von der Linkerlänge abhängige Hydrolysekinetik (Abb. 1d). Obwohl alle Prodrugs in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 37 °C in Abwesenheit von PLE hydrolysebeständig waren, wurden die meisten Prodrugs (~90 %) innerhalb von 30 Minuten in chemisch unmodifizierte STING-Agonisten umgewandelt Vorhandensein von Esterase in vitro. Die Geschwindigkeitskonstanten pseudo-erster Ordnung (± sd) für die Freisetzung von STING-Agonisten aus diesen Prodrugs betrugen 31,9 ± 0,3 × 10−3 min−1 (Prodrug 1), 23,9 ± 3,5 × 10−3 min−1 ( Prodrug 2), 64,1 ± 0,2 × 10−3 min−1 (Prodrug 3) und 199,1 ± 1,2 × 10−3 min−1 (Prodrug 4) (Abb. 1e, f).

Als nächstes testeten wir die Fähigkeit dieser MSA-2-Prodrugs, sich zu liposomalen Nanovesikeln (SAProsomen) zusammenzufügen. Das Stammmolekül MSA-2 war mit liposomalen Komponenten nicht mischbar und führte ausschließlich in wässrigen Lösungen zu Niederschlägen. Umgekehrt waren die MSA-2-Prodrugs 1–4 nach dem Nanopräzipitationsprotokoll hochgradig kompatibel mit liposomalen Komponenten, mit einer Beladungseffizienz von >90 % für die verschiedenen Prodrugs (Tabelle S1). Für diese mit Wirkstoffen beladenen Nanopartikel wurden typische nanoskalige liposomale Strukturen gebildet, wie durch Transmissionselektronen- und Kryoelektronenmikroskopie-Beobachtungen (Abb. 1g) belegt30. Darüber hinaus wiesen diese SAProsomen einen geeigneten z-Durchschnittsdurchmesser von ~120 nm auf, gemessen durch dynamische Lichtstreuung, und eine enge Größenverteilung, was sich in einem niedrigen Polydispersitätsindex widerspiegelte. Alle SAProsomen mit Ausnahme von SAProsom-4 blieben in gepufferten Lösungen mit Serum (20 %, w/v) ausreichend stabil (Abb. 1h, i).

Anschließend wurde untersucht, ob SAProsomen die zelluläre Aufnahme erleichtern und die immunstimulierende Aktivität von STING-Agonisten aufrechterhalten können. Die intrinsische Fluoreszenz von MSA-2 wurde zur Quantifizierung der intrazellulären Arzneimittelkonzentration ausgewertet, da die Fluoreszenzspektren unabhängig von der chemischen Derivatisierung unbeeinflusst blieben (ergänzende Abbildung S11). Die Exposition von Zellen gegenüber SAProsomen erzeugte wesentlich höhere von MSA-2 abgeleitete Fluoreszenzsignale als die Exposition gegenüber freiem MSA-2 (Abb. 2a, b), was darauf hindeutet, dass die zelluläre Aufnahme von MSA-2 durch liposomale Abgabe beschleunigt wurde. Wir untersuchten weiter, ob eine erhöhte zytosolische Abgabe zu einer stärkeren Entzündungssignalisierung beitrug. Die In-vitro-Stimulation von aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDC) mithilfe von SAProsom erhöhte die mRNA-Expression von nachgeschalteten STING-regulierten Zytokinen wie IFN-β, Tumornekrosefaktor Alpha (TNFα) und dem Chemokin-Liganden (CXC-Motiv) 10 ( CXCL10), wohingegen freies MSA-2 die mRNA-Expression nachgeschalteter Zytokine weniger wirksam steigerte (Abb. 2c). CXCL10 gilt als Chemoattraktor für die Förderung der intratumoralen Infiltration von T-Zellen, wohingegen IFN-β und TNFα entscheidende Immunmodulatoren für die Verstärkung der Antitumorreaktionen sind31,32,33. Darüber hinaus wurde in BMDCs eine dosisabhängige Sekretion des kritischen Zytokins IFN-β nach der Behandlung mit SAProsomen beobachtet (Abb. 2d), was es ermöglichte, die überlegene Aktivität von SAProsom-3 und 4 bei relativ niedriger halbmaximaler wirksamer Konzentration zu identifizieren (EC50). Wir haben ihr Potenzial zur STING-Aktivierung in der menschlichen monozytischen Zelllinie THP1 weiter validiert. In Übereinstimmung mit den In-vitro-Ergebnissen wurde aktives MSA-2 nach der Zellaufnahme spontan aus SAProsom-3 freigesetzt (ergänzende Abbildung S12). Darüber hinaus steigerte die SAProsom-3-Behandlung nicht nur die mRNA-Expression von IFN-β, TNFα und CXCL10, sondern löste auch nachgeschaltete STING-Signalkaskaden aus, wodurch die Phosphorylierung des STING-Proteins, der TANK-bindenden Kinase 1 (TBK1) und des IFN-Regulierungsfaktors 3 induziert wurde ( IRF-3) in THP1-Zellen (Ergänzende Abbildung S13).

a, b Profile der intrazellulären MSA-2-Fluoreszenzintensität, quantifiziert mittels Durchflusszytometrie (linkes Feld). SAProsomen verbessern die zytosolische Abgabe von MSA-2 in aus dem Knochenmark stammenden DCs (BMDCs) (a) oder THP-1-Zellen (b). Die Zellen wurden mit freiem MSA-2 oder verschiedenen SAProsomen (40 µM MSA-2-Äquivalenz) inkubiert. Repräsentative durchflusszytometrische Histogramme, die die Aufnahme von fluoreszierendem MSA-2 oder Prodrugs nach einer 24-stündigen Inkubation zeigen (rechtes Feld). Die Daten werden als ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt, n = 3 biologisch unabhängige Zellen. c STING-abhängige Downstream-Expression von entzündlichen Zytokinen in mit MSA-2 oder SAProsomen behandelten BMDCs, ermittelt mittels qRT-PCR (n = 3). d Dosis-Wirkungs-Kurven der IFN-β-Sekretion bei verschiedenen Behandlungen. Die Konzentration von IFN-β im BMDC-Kulturmedium wurde mittels Enzymimmunoassay (ELISA) bestimmt. Die Daten werden als ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt, n = 3 biologisch unabhängige Proben. e, f Nach der Behandlung mit SAProsomen weisen BMDCs deutlich erhöhte Aktivierungsmarker auf, einschließlich des Haupthistokompatibilitätskomplexes II (MHC II) (e) und CD80/CD86 (f) (n = 3). g Augmentierte Antigen-Kreuzpräsentation von BMDCs, induziert durch SAProsomen. Der Prozentsatz der Ovalbumin (OVA, SIINFEKL)-präsentierenden Zellen wurde mittels Durchflusszytometrie bestimmt (n = 3). h Die gleichzeitige Behandlung mit dem OVA-Peptid und SAProsomen erhöhte die B16F10-OVA-Zelllyse über zytotoxische T-Lymphozyten in vitro. Auf der linken Seite ist das Versuchsprotokoll dargestellt, das mit BioRender.com erstellt wurde. Die Zellzytotoxizität wurde anhand der Laktatdehydrogenase (LDH)-Konzentration im Mediumüberstand bestimmt, gemessen mit dem LDH-Assay (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Die Zellzahlverhältnisse (T-Zelle/B16F10- oder B16F10-OVA-Zelle/BMDC) wurden auf 10:1:5 festgelegt. In (c, e–h) werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse statistisch analysiert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Angesichts der überlegenen Aktivität von SAProsomen bei der Stimulierung des STING-Signalwegs und der IFN-β-Sekretion untersuchten wir weiter, ob diese Stimulation die DC-Reifung in vitro induzierte. Die DC-Reifungsanalyse ergab, dass SAProsomen die Expression des Haupthistokompatibilitätskomplexes II (MHC II) und der kostimulatorischen Marker von CD80/CD86 in BMDCs signifikant hochregulierten (Abb. 2e, f). Die allgemeine Induktion der DC-Reifung über alle SAProsomen zeigte eine vergleichbare Reaktion, obwohl SAProsom-4 eine überlegene zelluläre Aufnahmeeffizienz und IFN-β-Sekretion aufwies. Die DC-Reifung geht mit einer erhöhten Antigenpräsentationskapazität einher34. Daher haben wir die Fähigkeit von SAProsomen untersucht, das umhüllte Antigen durch Kreuzpräsentation auf BMDC-Oberflächen zu fördern. BMDCs, die SAProsomen ausgesetzt waren, verbesserten die SIINFEKL-H-2Kb-Präsentation signifikant um das 2,9- bis 3,4- bzw. 1,8- bis 2,1-fache im Vergleich zur Präsentation in Zellen, die mit Kochsalzlösung bzw. freiem MSA-2 behandelt wurden (Abb. 2g). Entscheidend ist, dass die Vorbehandlung von BMDCs mit SAProsomen und einem tumorspezifischen Antigen (z. B. OVA) die Zytotoxizität von Milz-T-Zellen gegenüber Tumorzellen (B16F10-OVA) im Vergleich zu unbehandelten Zellen signifikant erhöhte (Abb. 2h). Im Gegensatz dazu zeigten Milz-T-Zellen eine begrenzte Zytotoxizität gegenüber B16F10-Tumorzellen. Diese experimentellen Ergebnisse deuten darauf hin, dass intrazelluläre Esterase spontan die Freisetzung von aktivem MSA-2 auslösen kann, was schließlich die Aktivierung des STING-Signalwegs erleichtert und zu einer verstärkten Sekretion von Zytokinen führt.

Liposomale Vesikel des MSA-2-Prodrugs ermöglichten die systemische Verabreichung per intravenöser Injektion. Zunächst wurde ein präklinisches Mausmodell mit einem subkutanen kolorektalen MC38-Tumor einbezogen, um die Antitumorwirksamkeit dieser SAProsomen im Vergleich zu oral verfügbarem freien MSA-2 zu testen (Abb. 3a). Nach drei intravenösen Injektionen von SAProsomen wurde eine signifikante Schrumpfung des Tumors beobachtet, wohingegen die Dosierung von freiem MSA-2 von 35 mg/kg das Tumorwachstum nicht hemmen konnte. Dieses Ergebnis wurde durch die an jedem anderen Tag überwachten Tumorwachstumskinetiken weiter gestützt (Abb. 3b – f). Im Vergleich dazu zeigten leere Liposomen ohne Pro-Drug-Nutzlasten in diesem Modell keine Antitumorvorteile (ergänzende Abbildung S14). SAProsomen schienen bei Tieren sicher und gut verträglich zu sein, was durch das stabile Wachstum des Körpergewichts der Mäuse belegt wurde (Abb. 3c). Die Behandlung mit SAProsomen führte zu einer vollständigen Tumorregression (CR), und die Tumorhemmungsraten hingen stark von den eingekapselten MSA-2-Prodrugs ab. Bemerkenswerterweise übertraf SAProsom-3 die anderen SAProsomen mit einer CR-Rate von 100 % und alle Mäuse (n = 10) blieben am Studienendpunkt tumorfrei (Abb. 3d). Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) von Tumorschnitten ergab höhere nekrotische Bereiche in den Tumoren von Mäusen, die mit SAProsom-3 behandelt wurden, was durch immunhistochemische TUNEL-Analyse weiter bestätigt wurde (Abb. 3g und ergänzende Abb. S15 und 16). Bemerkenswerterweise enthielten Tumore in mit freiem MSA-2 behandelten Mäusen jedoch nur wenige CD8+-T-Zellen, wohingegen die Tumoren von mit SAProsom-3 behandelten Mäusen reichlich mit CD8+-T-Zellen infiltriert waren und von einer starken Diffusion von Granzym B begleitet waren, einem charakteristischen Merkmal von T-Zellfunktion (Abb. 3g und ergänzende Abb. S17). Darüber hinaus verlängerte die Behandlung mit SAProsomen effektiv die Überlebenszeit im Vergleich zu der mit freier MSA-2-Verabreichung beobachteten Zeit (mittlere Überlebenszeit [MST]: MSA-2 = 15 Tage; SAProsomen 1, 2 und 4 = 93–99 Tage) (Abb . 3h). In Übereinstimmung mit den Tumorwachstumskurven verlängerte SAProsom-3 die MST tumortragender Mäuse über 150 Tage erheblich.

a Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus mit einem syngenen Maustumormodell. Mäusen mit etwa 100 mm3 subkutanen Tumoren wurden dreimal intravenös SAProsomen in einer MSA-2-äquivalenten Dosis von 35 mg/kg verabreicht. Zum Vergleich wurde freies MSA-2 einbezogen, das über eine orale Sonde oder Kochsalzlösung verabreicht wurde. Tumorwachstumskinetik (b) und Körpergewichtsveränderungen (c) in den verschiedenen Gruppen (n = 10 Mäuse/Gruppe). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests statistisch analysiert. d Tumorwachstumskurven für einzelne Mäuse (CR, vollständiger Responder). e Repräsentative Fotos von MC38-Tumoren am 12. Tag. f Wasserfalldiagramm, das die Reaktion von MC38-Tumoren auf verschiedene Behandlungen nach 12 Tagen zeigt (die Werte stellen die Volumenänderung im Vergleich zum Ausgangswert vor der Behandlung dar). g Repräsentative Hämatoxylin- und Eosin-Färbung, terminale Desoxynukleotidyltransferase-vermittelte dUTP-Nick-End-Markierungsanalyse (TUNEL) und Immunfluoreszenztest von zytotoxischen CD8+-T-Zellen in exzidierten Tumoren am Tag 10 nach der Behandlung. Dreifache Versuche wurden unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. h Kaplan-Meier-Überlebensanalyse (n = 10 Mäuse/Gruppe). Die statistische Signifikanz wurde mithilfe von Log-Rank-Tests (Mantel-Cox) bestimmt. i Tumorwachstumskurven und Kaplan-Meier-Überlebensanalyse nach Reinokulation von MC38-Zellen in Mäusen, die kein erneutes Auftreten des Sekundärtumors bei mit SAProsom 3 behandelten Mäusen zeigen (n = 10/Gruppe). Als Kontrolle wurden behandlungsnaive Mäuse (n = 10/Gruppe) einbezogen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und mithilfe des zweiseitigen Student-t-Tests statistisch analysiert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die immunologischen Gedächtniseffekte weiter zu bewerten, wurden mit SAProsom 3 behandelte Mäuse, die am Tag 150 nach der ersten Inokulation mit MC38-Tumorzellen überlebten, erneut mit MC38-Zellen belastet35. Verglichen mit dem schnellen Tumorwachstum bei den behandlungsnaiven Mäusen kam es bei allen mit SAProsom 3 behandelten Mäusen während des 60-tägigen Beobachtungszeitraums nicht zu einem sekundären Tumorrezidiv, was auf die Etablierung eines dauerhaften tumorspezifischen immunologischen Gedächtnisses hinweist (Abb. 3i).

Als nächstes analysierten wir den Unterschied in den immunregulatorischen Wirkungen im Tumorgewebe von Mäusen, die mit SAProsom-3 und freiem MSA-2 behandelt wurden, mittels Durchflusszytometrie. Durch die Verabreichung von SAProsom-3 wurden die zytotoxischen CD3+CD8+-T-Zell-Untergruppen in Tumoren im Vergleich zur Behandlung mit freiem MSA-2 signifikant erweitert (Abb. 4a und ergänzende Abb. S18). Das CD8+/CD4+ T-Zell-Verhältnis, ein entscheidender prognostischer Indikator für die Ergebnisse der Immuntherapie, stieg nach der Behandlung mit SAProsom-3 im Vergleich zu der unbehandelten Gruppe signifikant an (2,82 gegenüber 0,26, P = 0,0000004)36. Die Populationen multipler Effektor-CD4+- und CD8+-T-Zellen waren in den Tumoren von Mäusen, die mit SAProsom-3 immunisiert waren, stark angereichert (Abb. 4b). Insbesondere gab es einen signifikanten Anstieg der aktivierten IFN-γ+CD8+ T-Zellen bei mit SAProsom-3 behandelten Mäusen im Vergleich zu dem, der in den unbehandelten oder MSA-2-Gruppen beobachtet wurde (37,2 % gegenüber 15,7 % oder 18,0 %, P = 0,000002 oder). P = 0,000009). Darüber hinaus nahm die Oberflächenexpression von CD206 – einem kanonischen Marker für M2-polarisierte Makrophagen – in den Makrophagen von mit SAProsom 3 behandelten Maustumoren dramatisch ab (Abb. 4c und ergänzende Abb. S19), was auf eine Repolarisation oder Rekrutierung von Makrophagen während der Reduktion hindeutet immunsuppressive Aktivität37,38. Der Zustrom tumorinfiltrierender natürlicher Killerzellen (NK) war während der Behandlung mit SAProsom-3 signifikant höher als während der Behandlung mit freiem MSA-2 (Abb. 4d). Darüber hinaus wurde im TME eine erhöhte DC-Expression von kostimulatorischem CD80/CD86 beobachtet, was mit dem erheblichen Anstieg der Tumor-CD8+-T-Zellen in mit SAProsom-3 behandelten Mäusen übereinstimmt (Abb. 4e und ergänzende Abb. S20). Von myeloiden Suppressorzellen (MDSC) ist bekannt, dass sie eine immunsuppressive Aktivität aufweisen und bei der Immunumgehung von Tumoren wichtig sind. Hier reduzierte die SAProsom-3-Behandlung die Infiltration intratumoraler MDSCs im Vergleich zu anderen Behandlungen erheblich (Abb. 4f, g).

a Durchflusszytometrische Diagramme von T-Zellen in MC38-Tumorgewebe, analysiert am Tag 10 nach der Behandlung (Gating auf CD3+-Zellen, n = 8 Mäuse/Gruppe für biologisch unabhängige Proben). b Intrazelluläre Zytokinfärbung zur Bewertung der TNFα- und IFN-γ-Produktion durch tumorinfiltrierende CD4+- und CD8+-T-Zellen als Reaktion auf die Stimulation mit Phorbolmyristatacetat/Ionomycin und die Häufigkeit von CD107a+-T-Zellen in den Tumoren wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert (n = 9 biologisch). unabhängige Stichproben). c Durchflusszytometrische Diagramme und quantitative Analyse von M1- und M2-ähnlichen Makrophagen innerhalb des TME (n = 7 biologisch unabhängige Proben). d, e Zellanteile von NK-Zellen in CD45+-Zellen (d) und dendritischen Zellen (DC), die CD80/CD86 (e) in Tumoren exprimieren (n = 8/Gruppe). f, g Häufigkeit granulozytischer und monozytischer myeloischer Suppressorzellen (MDSC) (gMDSC bzw. mMDSC) in Tumoren (n = 8 biologisch unabhängige Proben). h Durchflusszytometrie-Streudiagramme und Quantifizierung der CD80/CD86-Expression durch DCs in den tumordrainierenden Lymphknoten (TDLN) (n = 8 biologisch unabhängige Proben). i Häufigkeit von CD3+CD8+- und CD3+CD4+-T-Zellen und das Verhältnis von CD8+-zytotoxischen T-Zellen zu CD4+-T-Zellen (n = 8 Proben/Gruppe) in TDLNs nach der Behandlung. j Makrophagen-Polarisationsprofile in TDLNs (n = 8 biologisch unabhängige Proben). k–m Splenozyten von Mäusen in jeder Behandlungsgruppe wurden am 10. Tag mittels Durchflusszytometrie analysiert, um die Häufigkeit von durch CD4+- und CD8+-T-Zellen (k) aktivierten DCs, die kostimulatorische CD80/CD86-Moleküle exprimieren (l) und M1- und M2-ähnlichen Makrophagen zu untersuchen (m) wurden auch in der Milz analysiert. n = 8 biologisch unabhängige Proben. In a–m werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse statistisch analysiert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Fähigkeit von SAProsom-3, Antigen-präsentierende Zellen in vivo zu aktivieren, weiter zu beurteilen, isolierten wir tumordrainierende Lymphknoten (TDLN) aus Mäusen für die durchflusszytometrische Analyse. Der Anteil ausgereifter DCs, wie durch CD80+/CD86+ DCs angezeigt, im TDLN von mit SAProsom-3 behandelten Mäusen war 3,0- bzw. 2,1-fach größer als der von Mäusen, die mit Kochsalzlösung bzw. freiem MSA-2 behandelt wurden (Abb. 4h). ). Intravenös injiziertes SAProsom-3 erhöhte die Anzahl der CD8+-T-Zellen signifikant und förderte die M2-zu-M1-Repolarisierung von Makrophagen in TDLNs (Abb. 4i, j). Darüber hinaus wurden signifikant erhöhte Spiegel an CD8+-T-Zellen und die Reifung robuster DCs sowie eine Förderung der M2-zu-M1-Repolarisation in der Milz beobachtet (Abb. 4k–m). Zusammenfassend liefern diese Ergebnisse überzeugende Beweise dafür, dass SAProsom-3 eine robuste Immunaktivierung auslöst und so zu einer anhaltenden Tumorregression im hier verwendeten präklinischen MC38-Modell beiträgt.

Eines der größten Probleme in der Onkologie ist das erneute Auftreten von Krebserkrankungen aufgrund von Metastasen, die trotz erfolgreicher Entfernung des Primärtumors bei zahlreichen Patienten auftreten. Daher haben wir die therapeutische Wirksamkeit von SAProsom-3 in diesem klinisch wichtigen Umfeld nach der chirurgischen Resektion primärer und früher metastasierter Tumoren untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein orthotopisches dreifach negatives Brustkrebsmodell mit spontaner Metastasierung etabliert, indem Luciferase-exprimierende 4T1-Zellen (4T1-luc) in die Brustfettpolster immunkompetenter syngener BALB/c-Mäuse geimpft wurden (Abb. 5a)39. SAProsom-3 induzierte in diesem Modell effektiv die anhaltende Regression von Primärtumoren (Abb. 5b) mit stabilem Körpergewichtswachstum (ergänzende Abb. S21); Dieses Ergebnis wurde durch die negative Biolumineszenz in der Behandlungsgruppe weiter gestützt (Abb. 5c und ergänzende Abb. S22). Am 13. Tag wurden orthotope Tumoren chirurgisch entfernt und anschließend wurde eine postoperative In-vivo-Biolumineszenzbildgebung durchgeführt, um die metastatische Belastung sichtbar zu machen (Abb. 5d). SAProsom-3 zeigte eine deutliche therapeutische Wirksamkeit bei der Hemmung von Tumormetastasen ohne nachweisbare Biolumineszenzsignale aus 4T1-Zellen im Vergleich zu denen, die bei Mäusen beobachtet wurden, die nur mit MSA-2 behandelt wurden. Wichtig ist, dass die Überlebensrate in der SAProsom-3-Behandlungsgruppe innerhalb von 120 Tagen deutlich auf 100 % (n = 5) anstieg (Abb. 5e).

a Schematische Darstellung der STING-aktivierenden Immuntherapie zur Behandlung spontaner Tumormetastasen im orthotopen 4T1-Brusttumormodell. 4T1-luc-Zellen (2,0 × 105) wurden in die Brustfettpolster von syngenen BALB/c-Mäusen inokuliert. Wenn die 4T1-Tumore ein Volumen von ~100 mm3 erreichten, wurden die Mäuse an den Tagen 0 und 20 mit Kochsalzlösung (intravenöse Injektion), freiem MSA-2 (orale Verabreichung), Prodrug 3 (orale Verabreichung) oder SAProsom-3 (intravenöse Injektion) behandelt 4. Am 12. Tag wurden die primären orthotopen Tumoren bei jeder Maus chirurgisch entfernt, um die Metastasen von 4T1-luc-Krebszellen weiter zu verfolgen. Erstellt mit BioRender.com. b Primäre Tumorwachstumskurven von 4T1-tumortragenden Mäusen in verschiedenen Behandlungsgruppen (n = 5 Mäuse/Gruppe). Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt. c In-vivo-Biolumineszenzbilder von tumortragenden Mäusen (linkes Feld) vor der Operation und herausgeschnittene Primärtumorgewichte (rechtes Feld). n = 5 biologisch unabhängige Tiere. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA bestimmt. d Ganzkörper-Biolumineszenzbildgebung zur Verfolgung der Tumorlast bei verschiedenen medikamentenbehandelten Mäusen. e Das Überleben der Mäuse wurde über einen Zeitraum von 120 Tagen nach der Operation überwacht (n = 5 Mäuse/Gruppe, Log-Rank-Mantel-Cox-Test). f–i Gewichte der Organe, einschließlich der Organe der Leber (f), der Lunge (g), der Milz (h) und der tumordrainierenden Lymphknoten (TDLN) (i) in jeder Behandlungsgruppe. Mäuse wurden am 30. Tag zur Organentfernung eingeschläfert (n = 3 Mäuse/Gruppe). Einschub: repräsentative Fotos von entnommenen Organen. Die Anzahl der Metastasenherde in der Lunge wurde gezählt (g). Rote Pfeile oder Kreise weisen auf Tumormetastasen hin. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA berechnet. j Histologische Analyse von Organschnitten mittels H&E-Färbung zur Untersuchung der Metastasierung. Die Bilder im rechten Bereich sind die Vergrößerung des Bereichs im schwarzen Rechteck. Dreifache Versuche wurden unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir untersuchten zusätzlich die hemmende Wirkung von SAProsom-3 auf die Tumormetastasenlast. Das Organgewicht wurde mit dem Metastasenwachstum in Zusammenhang gebracht. Wir beobachteten bei mit SAProsom 3 behandelten Mäusen eine signifikante Verringerung des Organgewichts, beispielsweise der Leber, der Lunge und der Milz, sowie eine Verringerung der Makrometastasen (Abb. 5f – h). Darüber hinaus führte die Behandlung mit SAProsom-3 zu geringeren TDLN-Gewichten im Vergleich zu denen, die bei anderen Behandlungen beobachtet wurden (Abb. 5i). Die Organschnitte wurden mittels H&E-Färbung histologisch analysiert, um die Metastasierung weiter zu untersuchen. Erfreulicherweise zeigten die Organe der mit SAProsom-3 behandelten Mäuse eine normale Morphologie und es wurden keine Rückfälle oder metastatischen Knötchen beobachtet (Abb. 5j). Daher kamen wir zu dem Schluss, dass SAProsom-3 ein erhebliches Potenzial zur Verhinderung von Metastasenrückfällen aufweist, wodurch die krebsbedingte Mortalität verringert und das Überleben verlängert wird.

Als nächstes versuchten wir, die therapeutische Wirksamkeit von SAProsom-3 mit freiem MSA-2 zu vergleichen. Das Maustumormodell mit Lewis-Lungenkarzinom (LLC) wurde etabliert und die Tiere wurden mit unterschiedlichen Dosen und Verabreichungswegen von Therapeutika behandelt. In jeder Behandlungsgruppe wurde eine dosisabhängige Antitumoraktivität beobachtet (Abb. 6a und ergänzende Abb. S23). Interessanterweise beobachteten wir in diesem Modell immer noch die bemerkenswerte Wirksamkeit von intravenösem SAProsom-3, das bei 50 bzw. 66,7 % der Mäuse bei 35 bzw. 40 mg/kg MSA-2-äquivalenten Dosen zu einer dauerhaften Tumorregression und vollständigen Reaktionen führte (Abb . 6a, b). Bemerkenswerterweise führte die Dosierung von SAProsom-3 bei 40 mg/kg zu einer deutlichen Schrumpfung des Tumorvolumens auf ~30 mm3. Im scharfen Gegensatz dazu zeigte freies MSA-2, das entweder oral oder intravenös verabreicht wurde, nur eine begrenzte Wirksamkeit gegen LLC-Tumoren (Abb. 6a – c und ergänzende Abb. S23). Wir bestätigten auch die Dosen von oralem MSA-2 mit 160 mg/kg, intravenösem MSA-2 mit 40 mg/kg und intravenösem SAProsom-3 mit 30 mg/kg (MSA-2-Äquivalenz), wodurch sie über einen vergleichbaren Antitumor verfügten Wirksamkeit in diesem Tiermodell (Abb. 6a – c). Die histologische Analyse mittels H&E-Färbung und TUNEL-positiver Zellmarkierung ergab eine ausgeprägte intratumorale Apoptose nach der Behandlung mit SAProsom-3 (ergänzende Abbildung S24). Darüber hinaus verstärkte die Verabreichung von SAProsom-3 die Infiltration von CD8+ T-Zellen in den Tumoren, was positiv mit einer erhöhten Produktion von Granzym B korrelierte (ergänzende Abbildung S24). Auch hier erwies sich SAProsom-3 als sicher für die intravenöse Verabreichung, was durch stabile Körpergewichte bei Tieren unterstützt wurde (Abb. 6d).

a–d LLC-tumortragende Mäuse wurden mit freiem MSA-2 über intravenöse (IV) Verabreichung oder orale Sondenernährung und mit SAProsom-3 nach intravenöser Injektion in den angegebenen MSA-2-äquivalenten Dosen behandelt. Dargestellt sind Tumorwachstumskurven (a), Spinnendiagramme einzelner Tumorwachstumskurven (b), Kaplan-Meier-Überlebenskurven (zweiseitiger Log-Rank-Test) (c) und Körpergewichtsveränderungen (d) von tumortragenden Mäusen ( n = 6 Mäuse/Gruppe). e–h Mäusen mit ~150 mm3 subkutanen B16F10-Tumoren wurde eine Einzeldosis Kochsalzlösung (IV), freies MSA-2 (PO) oder SAProsom3 (IV) entsprechend 35 mg/kg MSA-2 verabreicht. Zur kombinierten Behandlung mit dem Checkpoint-Blockade-Antikörper wurde den Mäusen zusätzlich dreimal intraperitoneal der Anti-PD-L1-Antikörper in einer Dosis von 5 mg/kg verabreicht (n = 6 Mäuse/Gruppe). f Tumorwachstumskurven für einzelne Mäuse. g Kaplan-Meier-Überlebensanalyse (zweiseitiger Log-Rank-Test). Die Mäuse wurden mit den angegebenen Formulierungen behandelt und als Endpunktkriterium wurde ein Tumorvolumen von 2000 mm3 festgelegt. h Veränderung des Körpergewichts von Mäusen mit B16F10-Tumor während der Behandlung (n = 6 Mäuse/Gruppe). In (a, d, e, h) werden die Daten als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse statistisch analysiert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Blockade des programmierten Zelltodproteins 1 (PD-1) oder seines Liganden (PD-L1) mit entsprechenden Antikörpern hat sich in der Klinik als vielversprechend erwiesen. Darüber hinaus kann die Blockierung der PD1/PD-L1-Achse in Kombination mit anderen Behandlungsmodalitäten zusätzliche therapeutische Vorteile bei der Krebsbehandlung bringen. Wir untersuchten daher die Wirksamkeit von optimiertem SAProsom-3 in Kombination mit PD-L1-basiertem ICB in einem syngenen murinen Tumormodell, einem immunologisch kalten und schlecht auf ICB reagierenden Tumor-B16F10-Melanom bei C57BL/6-Mäusen40. Die Behandlung wurde begonnen, als das Volumen der subkutanen Tumoren 100–200 mm3 erreichte. Die Verabreichung einer Monotherapie an diese etablierten Tumoren mit entweder einem Anti-PD-L1-Antikörper (αPD-L1) oder freiem MSA-2 verzögerte deren Wachstum nur teilweise (Abb. 6e, f). Bemerkenswerterweise führte die Behandlung mit SAProsom-3 zu einer starken Tumorsuppression im Vergleich zu der, die bei der Behandlung mit freiem MSA-2 beobachtet wurde (z. B. Hemmung des Tumorwachstums am Tag 10 von 92,3 % bzw. 24,4 % bei Behandlung mit SAProsom-3 bzw. MSA-2) ( Abb. 6e)41. Bemerkenswert ist, dass die Kombinationstherapie große etablierte Tumoren bei Mäusen am Tag 10 nach der Verabreichung von SAProsom-3 und αPD-L1 beseitigte, während die Wirksamkeit über den gesamten Beobachtungszeitraum anhielt (Abb. 6e, f). Mäuse in allen Gruppen behielten ein normales Körpergewichtswachstum bei, was darauf hindeutet, dass die Behandlungen keine schwere Toxizität hervorriefen (Abb. 6g). Darüber hinaus war die MST von Mäusen, die mit der Kombinationstherapie behandelt wurden, im Vergleich zu anderen Gruppen auf 27 Tage verlängert (z. B. MST-Kochsalzlösung = 10 Tage) (Abb. 6h)42. Diese Ergebnisse unterstützen die Synergie zwischen der PD-L1-Hemmung und der SAProsom-3-vermittelten STING-Aktivierung bei der Auslösung einer robusten systemischen Antitumorimmunität.

Wir haben den Mechanismus der liposomalen Abgabe zur Verbesserung der Antitumorimmunität weiter untersucht, der in mehreren In-vivo-Modellen beobachtet wurde, indem wir die pharmakokinetischen Profile und die Arzneimittelverteilung in Tumoren und Lymphknoten untersuchten. Die pharmakokinetischen Profile von SAProsom bei Sprague-Dawley-Ratten nach einmaliger intravenöser Injektion wurden durch Messung der Arzneimittelkonzentrationen im Plasma bestimmt43. Zum Vergleich wurde freies MSA-2 einbezogen, das entweder oral oder intravenös verabreicht wurde. Die Plasmakonzentration von Gesamt-MSA-2 im Vergleich zur Zeit und die damit verbundenen pharmakokinetischen Parameter sind in Abb. 7a bzw. b dargestellt. Bemerkenswerterweise zeigten die über Liposomen abgegebenen MSA-2-Prodrugs eine verlängerte systemische Zirkulation mit Halbwertszeiten im Bereich von 4,61 bis 5,95 Stunden, was 5,6–7,3-fach höher ist als die, die nach intravenöser MSA-2-Injektion beobachtet wurden (t1/2 = 0,82 Stunden). . Bemerkenswerterweise zeigte die Fläche unter der Konzentrations-Zeit-Kurve (AUC0–t), dass SAProsom-3 die höchste AUC0–t aufwies, 10,6-fach größer als die bei oral verabreichtem MSA-2 beobachtete.

a Arzneimittelkonzentration im Plasma von Sprague-Dawley-Ratten (n = 3 Ratten/Gruppe) nach einmaliger Verabreichung verschiedener Arzneimittel in einer MSA-2-Äquivalentdosis von 17,5 mg/kg. Die Daten werden als ± Standardabweichung des Mittelwerts dargestellt. b Pharmakokinetische Parameter, die Halbwertszeit (t1/2), C0, Cmax, Fläche unter der Kurve (AUC0–t) und mittlere Verweilzeit (MRT) widerspiegeln. Mäusen mit MC38- (c), 4T1- (d) oder B16F10-Xenotransplantattumoren (e) wurde eine Einzeldosis MSA-2 und SAProsom-3 verabreicht (n = 6 Mäuse/Gruppe). Die Arzneimittelkonzentration in Tumoren und Lymphknoten wurde mittels HPLC-Analyse 8 und 24 Stunden nach der Verabreichung bestimmt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt und mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse statistisch analysiert. f, g C57BL/6-Mäuse wurden mit freiem MSA-2 oral in einer Dosis von 240 mg/kg oder intravenös in einer Dosis von 60 mg/kg und SAProsom-3 intravenös in einer Dosis von 45 mg/kg pro Maus behandelt. alle drei Tage für insgesamt drei Injektionen (n = 4 Mäuse/Gruppe). Die Blutchemie der Mäuse wurde am 8. Tag nach der Verabreichung analysiert. Der Boxplot vermittelt den Median (mittlere Linie), das 25. und 75. Perzentil (Box) und den Minima- bis Maxima-Bereich (Whisker). Die Daten werden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse statistisch analysiert. h Die Konzentrationen von Interleukin 6 (IL-6) im Serum und anderen Geweben wurden mittels ELISA 6 Stunden nach der Verabreichung von freiem MSA-2 (PO, 240 mg/kg), freiem MSA-2 (IV, 60 mg/kg) bestimmt ) oder SAProsom-3 (IV, 45 mg/kg) (n = 5). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu klären, ob die verbesserte pharmakokinetische Eigenschaft von SAProsomen eine günstige Medikamentenverteilung in den Zielgeweben begünstigen kann, wurde die Konzentration von MSA-2 sowohl in den Tumoren als auch in den Lymphknoten nach der Behandlung in mehreren tumortragenden Mausmodellen untersucht. Freies MSA-2, das entweder durch intravenöse Injektion oder Magensonde verabreicht wurde, zeigte bei allen getesteten Mäusen eine vergleichsweise geringe Akkumulation in Tumor- und Lymphkompartimenten (Abb. 7c – e). Umgekehrt erhöhte die Verwendung von SAProsomen die MSA-2-Konzentration in diesen Tumoren erheblich auf das 19,0- bis 45,1-Fache höher als nach intravenöser Injektion von freiem MSA-2, was unsere Design-Grundlage für die Verwendung chemischer Arzneimittelderivatisierung und liposomenbasierter Verabreichung bestätigt . Als Einblick in die quantitativen Unterschiede zwischen SAProsomen und oralen MSA-2-Behandlungen beobachteten wir eine 22,0- bis 449,1-fach höhere Arzneimittelakkumulation in Tumoren nach der Verabreichung von SAProsom-3, was zur deutlich verbesserten Antitumorwirksamkeit von MSA-2 beitrug. Andererseits war die Verteilung von SAProsom-3 in anderen normalen Organen gering, während sich intravenös verabreichtes MSA-2 in einer höheren Konzentration im Herzen und in den Nieren anreicherte (ergänzende Abbildung S25).

Schließlich untersuchten wir die potenzielle Toxizität, die durch die systemische Verabreichung von STING-Agonisten hervorgerufen wird. Es wurde das gleiche Verabreichungsschema mit einer 1,5-fach höheren Dosis als die im LLC-Modell verwendeten therapeutisch relevanten Dosen getestet. Die biochemische Analyse des Serums zeigte, dass nach der Behandlung mit SAProsom-3 alle Parameter im Vergleich zur gesunden Gruppe unverändert blieben (Abb. 7f, g). Im Gegensatz dazu kam es bei den Tieren, denen intravenös MSA-2 verabreicht wurde, zu einem signifikanten Anstieg der Aspartat-Aminotransferase (AST) und Alanin-Aminotransferase (ALT), was auf offensichtliche Lebertoxizitäten hinweist. Darüber hinaus führte die orale Verabreichung von MSA-2 auch zu deutlich erhöhten Serumenzymwerten, einschließlich AST, ALT, Urinsäure (UA) und Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN). Die histologische Untersuchung von Organschnitten deutete auch auf offensichtliche Toxizitäten für Leber- und Nierengewebe nach Behandlung mit freiem MSA-2 durch intravenöse oder orale Verabreichung hin, während mit SAProsom-3 behandelte Tiere nicht von unbehandelten Tieren zu unterscheiden waren (ergänzende Abbildung S26). Wir fanden eine akute Entzündung in den mit freien Medikamenten behandelten Gruppen, die durch erhöhte Werte an entzündlichen Zytokinen/Chemokinen gekennzeichnet war (Abb. 7h und ergänzende Abb. S27). Bemerkenswert ist, dass Interleukin 6 (IL-6, ein wichtiger Treiber des Zytokinsturms) im Serum von Mäusen, die oral oder intravenös mit MSA-2 behandelt wurden, einen 12,5- oder 18,6-fach höheren Spiegel aufrechterhielt als der von SAProsom-3 (Abb. 7h). ). Im Gegensatz dazu zeigte SAProsom-3 eine vernachlässigbare Fluktuation dieser Zytokine/Chemokine im Serum und in gesunden Organen, was auf minimierte systemische Entzündungen und Immuntoxizitäten hinweist.

Die Immuntherapie hat enorme Auswirkungen auf die Behandlung eines breiten Spektrums von Krebsarten, einschließlich metastasiertem Krebs. Allerdings zeigte die klinisch zugelassene ICB-Monotherapie bei nicht ausgewählten Populationen von Krebspatienten verringerte Ansprechraten. Diese ungünstige Reaktion ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen, wie z. B. eine geringe Anzahl immunogener Neoantigene, mehrere immunsuppressive Merkmale im TME und einen Mangel an tumorinfiltrierenden Lymphozyten44. Dies führte zu Bemühungen, neuartige Behandlungsmöglichkeiten zur Bekämpfung von ICB-nicht-responsivem Krebs zu entwickeln. Die Aktivierung der angeborenen Immunität führt möglicherweise zu einer stärkeren adaptiven Antitumor-Immunität, die eine erhöhte Anzahl tumorinfiltrierender Lymphozyten und stärkere Behandlungsreaktionen induziert45. Als angeborener Immunregulator ist das STING-Protein ein entscheidender Sensor für selbst und von Krankheitserregern stammende DNA-Moleküle und löst zahlreiche Abwehrwege des Wirts gegen Viren oder Bakterien aus. Darüber hinaus kann die STING-vermittelte Immunität für die Entwicklung von Antitumor-Immuntherapien genutzt werden46. Die STING-Aktivierung über Agonisten löst nachgeschaltete Signalereignisse aus und führt zu einer erhöhten Sekretion von Zytokinen, einschließlich Typ-I-IFNs, die für immuntherapeutische Wirkungen unerlässlich sind. In jüngster Zeit wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um STING-Agonisten und verschiedene hochentwickelte Transportvehikel als Antitumortherapeutika zu entdecken47,48,49,50. CDN-basierte Agonisten sind hydrophil und negativ geladen. Die Formulierung von Nanopartikeln und die systemische Verabreichung dieser polaren Wirkstoffe für therapeutische Zwecke bleiben eine Herausforderung. Darüber hinaus stellte die skalierbare Synthese von cGAMP-Analoga erhebliche Hindernisse dar, die aufgrund ihrer funktionsdichten, polaren Strukturen ein langwieriges und langwieriges Syntheseprotokoll erforderten51. Im Gegensatz dazu ist die Synthesestrategie für diese hier beschriebenen Nicht-Nukleotid-MSA-2-Prodrugs unkompliziert und kann leicht im Gramm-Maßstab aus kommerziell erhältlichen Reagenzien hergestellt werden. Daher können wir davon ausgehen, dass diese Verbindungen für die weitere klinische Umsetzung von erheblichem Interesse sein könnten.

Die orale Verabreichung von MSA-2 führte in Tiermodellen nur zu geringen therapeutischen Reaktionen, sodass eine höhere Dosis für die Behandlung erforderlich war24. Unsere ersten Versuche, MSA-2 in hochmoderne Nanoträger wie Liposomen oder Polymermizellen einzukapseln, scheiterten an der geringen Mischbarkeit von MSA-2 mit diesen Matrizen. Wir vermuteten, dass die Carboxyleinheit (10-OH) am MSA-2-Molekül für diese Inkompatibilität verantwortlich sein könnte. Dies motivierte uns, diesen Agonisten für die adaptive Nanopartikelformulierung rational umzugestalten. Wir nutzten zunächst ein hydrophobes Tocopherol-Motiv, um ein MSA-2-Derivat (dh Prodrug 5) zu konstruieren (ergänzende Abbildung S28). Leider gelang es dem resultierenden Prodrug 5 nicht, die DC-Reifung zu fördern oder die Typ-I-IFN-Sekretion auszulösen. Die Hydrolysegeschwindigkeit der Esterbindung in diesem Pro-Drug-Gerüst war langsam, was die spontane Freisetzung von aktivem MSA-2 nach der Aufnahme durch Zellen hemmte. Darüber hinaus brachte das über Liposomen verabreichte, aus Tocopherol gewonnene STING-Prodrug im Vergleich zu oral verabreichtem freiem MSA-2 keine zusätzlichen therapeutischen Vorteile nach intravenöser Injektion (ergänzende Abbildung S29). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine hohe intrazelluläre Konzentrationsschwelle für die STING-Aktivierung vorliegt und eine anhaltende und langsame Aktivierung von MSA-2 seine Wirksamkeit als STING-Aktivator abschwächt. Diese vorläufigen Ergebnisse veranlassten uns zu der Hypothese, dass robuste Immunantworten durch eine Verbesserung der Effizienz der Arzneimittelaktivierung durch die Optimierung der Linkerchemie und der gesamten Pro-Arzneimittel-Einheiten hervorgerufen werden könnten.

Inspiriert von dieser Hypothese nutzten wir Alkanole vom MP-Typ mit unterschiedlichen Kohlenwasserstoffkettenlängen als Promotoren, um die MSA-2-Verbindung chemisch umzugestalten. Von den resultierenden Prodrugs wurde erwartet, dass sie eine geringere Hydrophobie, eine geringere sterische Hinderung und eine bessere Zugänglichkeit für die Esterasehydrolyse aufweisen als die von Tocopherol abgeleiteten Prodrugs. Bemerkenswerterweise fanden wir heraus, dass diese Prodrugs die Esterase-katalysierte Bindungsspaltung begünstigen und so spontan biologisch aktive Medikamente regenerieren. Interessanterweise fanden wir auch heraus, dass die Kinetik der Wirkstoffaktivierung von der Kohlenstoffzahl im Pro-Wirkstoff-Linker abhängt. Im Vergleich zu Verbindung 5 wurden für diese Prodrugs beschleunigte Freisetzungsprofile beobachtet (ergänzende Abbildung S30); Beispielsweise wurden etwa 90 % der Prodrugs 3 oder 4 in Gegenwart von Esterase innerhalb von 30 Minuten in freies MSA-2 umgewandelt. Die schnelle Esterase-katalysierte Umwandlungsrate begünstigte ihre Fähigkeit, STING zu aktivieren und dadurch die nachgelagerte Produktion von Typ-I-IFNs zu initiieren, wie durch verschiedene zellbasierte In-vitro-Tests nachgewiesen wurde. Bemerkenswert ist, dass das hier vorgestellte Syntheseprotokoll für die Agonisten-Prodrugs im Vergleich zu den erheblichen Herausforderungen, die die skalierbare Synthese von cGAMP-Analoga mit sich bringt, unkompliziert ist. Diese Derivate können über ein zweistufiges Reaktionsprotokoll leicht im Grammmaßstab aus kommerziell erhältlichen Reagenzien hergestellt werden und sind daher für die Erleichterung der weiteren klinischen Umsetzung von Vorteil.

Liposomen stellen die vielversprechendsten Träger für die Arzneimittelabgabe für den klinischen Einsatz dar52. Derzeit sind zahlreiche Liposomenformulierungen zur Behandlung von Krankheiten auf dem Markt erhältlich, und weitere Formulierungen befinden sich in der präklinischen und klinischen Entwicklung. Im Gegensatz zur Unmischbarkeit von freiem MSA-2 mit Lipidbestandteilen kann das STING-Prodrug stabil in liposomalen Vesikeln verankert werden, um eine intravenöse Injektion für In-vivo-Untersuchungen zu ermöglichen. Die intravenöse Verabreichung von STING-aktivierenden liposomalen Vesikeln verbesserte die pharmakokinetischen Eigenschaften und die günstige Abgabeeffizienz von MSA-2 in den Tumoren oder Lymphknoten mehrerer Tumormodelle im Vergleich zu der Verabreichung von freiem MSA-2 erheblich. Bemerkenswerterweise übertraf SAProsom-3 die anderen SAProsomen. Wir haben offengelegt, dass die gesamten chemischen Strukturen von Prodrugs die Hydrolysekinetik und die Aktivierung von MSA-2 als Reaktion auf Esterase beeinflussen. Tatsächlich wurde in dieser Studie eine positive Korrelation zwischen der Hydrolyserate und der STING-stimulierenden Aktivität beobachtet. Darüber hinaus hatte SAProsom-3 die höchste AUC0-t, was teilweise seine überlegene Antitumorwirksamkeit erklären könnte. Trotz dieser Erkenntnisse müssen die Struktur-Aktivitäts-Beziehungen noch eingehend untersucht werden. Darüber hinaus löste intravenös verabreichtes SAProsom-3 im Einklang mit diesen Ergebnissen eine kräftige Tumorremission in MC38- und LLC-Mausmodellen aus und ermöglichte die vollständige Beseitigung etablierter Tumoren. Mechanistisch gesehen förderte die Behandlung mit SAProsom-3 eine Typ-I-IFN-gesteuerte angeborene Immunantwort und wandelte dadurch immunologisch kalte Tumoren in heiße um. Nach der Behandlung mit SAProsom-3 beobachteten wir tatsächlich eine erhöhte Tumorinfiltration durch funktionelle T-Zellen, NK-Zellen und aktivierte DCs sowie eine Änderung der Polarisation von Makrophagen vom protumorigenen M2- zum antitumorigenen M1-Phänotyp, was alles zu einem robusten Antitumor beitrug Immunantwort in diesem MC38-Modell. Insbesondere bei 4T1- und B16F10-Tumoren, die als immunologisch stumm gelten und für eine ICB-Monotherapie nicht geeignet sind, unterdrückte die intravenöse Verabreichung des optimierten SAProsom-3 wirksam das Tumorwachstum und die Metastasenlast, was eine weitere Synergie mit der αPD-L1-Immun-Checkpoint-Hemmung zur Verstärkung bewirkte therapeutischer Nutzen.

Obwohl die intratumorale Verabreichung von STING-Agonisten systemische Toxizitäten mildern kann, ist dieser Verabreichungsweg auf Patienten mit soliden, zugänglichen Tumoren beschränkt. Unsere experimentellen Ergebnisse liefern einen Proof-of-Concept dafür, dass STING-Agonisten mit geringer Wirksamkeit umfunktioniert und strukturell optimiert werden, um systemisch injizierbare, hochwirksame Nanotherapeutika zu erzeugen, die ihre Immun-Escape-Mechanismen ansprechen. Angesichts der deutlich verbesserten oralen Aktivität von Prodrug 3, die in den Experimenten beobachtet wurde, kann darüber hinaus eine zeitnahe Wirksamkeitsbewertung der Verwendung dieser Verbindung durch orale Verabreichung in Betracht gezogen werden. Nach der Sicherheitsbewertung sind prospektive klinische Studien zur Untersuchung der optimierten STING-aktivierenden Liposome allein oder in Kombination mit anderen Immuntherapien erforderlich.

Diese Forschung entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften. Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit dem National Institute Guide for the Care and Use of Laboratory Animals durchgeführt. Die Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission des First Affiliated Hospital der Zhejiang University School of Medicine genehmigt.

C57BL/6 (männlich, 4–6 Wochen, 18–20 g, #ZJCLA-202004), BALB/c-Mäuse (weiblich, 4–6 Wochen, 15–18 g, #ZJCLA-202101) und Sprague-Dawley-Ratten ( männlich, 6–8 Wochen, 200–220 g, #ZJCLA-202003) wurden vom Laboratory Animal Center des Hangzhou Medical College (Hangzhou, China) gekauft. Die Tiere wurden in speziellen pathogenfreien Tierversuchszentren aufgezogen und hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Alle Versuchs-/Kontrolltiere wurden unter Standardbedingungen (23–26 °C, 40–60 % Luftfeuchtigkeit, 12-stündiger Hell-Dunkel-Zyklus und 3–4 Mäuse oder Ratten/Käfig) gemeinsam in einem Wohnraum gehalten. Am Ende der Studie erfolgte die Euthanasie der Tiere durch CO2-Inhalation und anschließende Zervixluxation.

Die chemischen Strukturen der synthetisierten MSA-2-Prodrugs wurden mittels Protonen-Kernspinresonanz und hochauflösender Massenspektrometrie charakterisiert. Die Syntheseverfahren werden ausführlich in den ergänzenden Materialien und Methoden beschrieben.

SAProsomen wurden gemäß einer Ethanolverdünnungsmethode hergestellt, wie zuvor beschrieben. Kurz gesagt, zunächst wurde eine Lipidmischung aus Ei-Phosphatidylcholin, Cholesterin und 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-poly(ethylenglykol)2000 in Ethanol (0,9 ml) in einem Massenverhältnis von hergestellt 7:2:1. Als nächstes wurden 0,1 ml Dimethylsulfoxid mit MSA-2-Prodrug (20 mg/ml, äquivalent zu MSA-2) zu der obigen ethanolischen Lösung in einem auf 14:1 (Gew./Gew.) festgelegten Verhältnis von Lipiden zu MSA-2 gegeben ). Die Mischung (1 ml) wurde dann schnell in PBS (9 ml, pH = 7,4) injiziert, was stabile Liposomen in PBS mit einer MSA-2-äquivalenten Konzentration von 0,2 mg/ml ergab. Schließlich wurden die resultierenden SAProsomen 30 Minuten lang bei 100.000 × g mittels Ultrazentrifugation (Berkman, Optima™ L-100 XP Ultracentrifuge) erneut ausgefällt und dreimal mit PBS gewaschen, um organische Lösungsmittel zu entfernen. Die Wirkstoffkonzentration wurde mittels analytischer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt.

Die menschlichen Monozyten-Zelllinien THP1-Zellen und LLC-Zellen wurden von der Zellbank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (Shanghai, China) erworben und in Roswell Park Memorial Institute 1640-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 100 Einheiten/ml, kultiviert Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin. Die B16F10-OVA-Zelllinie wurde von Crisprbio (Peking, China) gekauft. Primäre BMDC-Kulturen wurden aus weiblichen C57BL/6-Mäusen etabliert. Kurz gesagt, Knochenmark wurde mit PBS aus isolierten Femuren gespült. Das Knochenmark wurde in Petrischalen ausgesät, die Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium enthielten, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1 % Penicillin-Streptomycin, 5 ng/ml Interleukin-4 und 20 ng/ml Maus-Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor. Die Hälfte des Kulturmediumvolumens wurde am 3. Tag aufgefrischt. Die nichtadhärenten Zellfraktionen dieser Kulturen (typischerweise >75 % CD11c+ mittels Durchflusszytometrie) wurden für Experimente zwischen dem 6. und 8. Kulturtag verwendet. Alle Zellen wurden in einer feuchten Atmosphäre bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.

Um die relative zelluläre MSA-2-Aufnahme zu quantifizieren, wurden BMDCs und THP1-Zellen (4 × 105/pro Well) in einer 24-Well-Platte ausplattiert, mit den angegebenen Formulierungen bei 40 μM MSA-2 behandelt und dann in PBS suspendiert analysiert mittels Durchflusszytometrie (DxFLEX, Beckman Coulter) unter Verwendung eines 405-nm-Anregungslasers und einer 450/45-nm-Filterkonfiguration.

Den Mäusen wurden 5 × 106 MC38-Zellen subkutan in die rechte Flanke geimpft. Die Tumorgröße wurde alle 2 Tage mit einem digitalen Messschieber gemessen und das Tumorvolumen als 0,5 × Länge × Breite2 berechnet. Bei Erreichen einer Größe von ~100 mm3 wurden die Tiere randomisiert in sechs Gruppen eingeteilt (n = 10 in jeder Gruppe). Drei Injektionen verschiedener SAProsomen wurden intravenös über die Schwanzvene in einer MSA-2-Dosis von 35 mg/kg an den Tagen 0, 4 und 8 verabreicht, während freies MSA-2 oral verabreicht und Kochsalzlösung als Kontrolle intravenös injiziert wurde. Tumorwachstum und Körpergewicht wurden alle 2 Tage überwacht und aufgezeichnet. Die Mäuse wurden gemäß den tierethischen Richtlinien unseres Instituts und den Tierschutzbestimmungen eingeschläfert, als das Tumorvolumen 2000 mm3 erreichte. Am Ende der Studie wurden die Mäuse durch CO2-Inhalation eingeschläfert.

Zur histologischen Analyse wurden die herausgeschnittenen Tumore und Organe in 4 % Paraformaldehyd in Phosphatpuffer fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5 μm dicke Scheiben geschnitten. Tumor- und Organschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Für den terminalen Desoxynukleotidyltransferase-vermittelten dUTP-Nick-End-Markierungstest (TUNEL) wurden die entparaffinierten und rehydrierten Tumorabschnitte 15 Minuten lang bei 37 °C mit Proteinase K inkubiert, zweimal mit PBS gespült und mit der TUNEL-In-situ-Zelltoderkennung gespült Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Sigma-Aldrich). Die TUNEL-gefärbten Zellen wurden mit Diaminobenzidin (DAKO) gegengefärbt. Um die Infiltration von Immunzellen zu beurteilen, wurden die Proben fixiert und mit Antikörpern (CD8a und Granzyme B, Biolegend) und DAPI gefärbt. Die Objektträger wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, IX71) abgebildet.

Die Plasmakonzentrationen von SAProsomen (bei einer MSA-2-äquivalenten Dosis von 17,5 mg/kg), die intravenös verabreicht wurden, wurden mit denen von freiem MSA-2 (17,5 mg/kg) verglichen, das oral oder intravenös bei Sprague-Dawley-Ratten (~200 g, n = 3 in jeder Gruppe). Nach der medikamentösen Behandlung wurden zu vorgegebenen Zeitpunkten Blutproben entnommen und sofort 10 Minuten lang bei 3000 × g zentrifugiert, und die resultierenden Plasmaproben wurden in Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt. MSA-2- und Prodrug-Konzentrationen nach vollständiger Hydrolyse wurden mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert.

Zur Durchführung aller statistischen Analysen wurde die Prism-Software Version 8.0 (GraphPad) verwendet. Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als ±Standardfehler des Mittelwerts dargestellt. Die statistische Signifikanz zwischen den Messungen wurde mithilfe des ungepaarten Student-t-Tests oder einer Einweg-Varianzanalyse bewertet. Überlebensstudien wurden mithilfe von Kaplan-Meier-Diagrammen analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle zur Bewertung der Schlussfolgerungen in der Arbeit erforderlichen Daten sind in der Arbeit und/oder den ergänzenden Materialien enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Zuschüsse 82273490, 82073296 und 81773193 an HW), dem Forschungsprojekt des Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory (Zuschuss JNL-2022010B an HW) und der Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China unterstützt (Gewähren Sie LR19H160002 an HW). Wir danken dem Zentrum für Kryo-Elektronenmikroskopie (CCEM) der Zhejiang-Universität für die technische Unterstützung für die TEM-Analyse. Wir danken Zhaoxiaonan Lin von den Core Facilities der Zhejiang University School of Medicine für ihre technische Unterstützung.

Das erste angeschlossene Krankenhaus, NHC-Schlüssellabor für kombinierte Multiorgantransplantation, kollaboratives Innovationszentrum für Diagnose und Behandlung von Infektionskrankheiten, staatliches Schlüssellabor für Diagnose und Behandlung von Infektionskrankheiten, Zhejiang University School of Medicine, 310003, Hangzhou, Provinz Zhejiang, VR China

Xiaona Chen, Fanchao Meng, Yiting Xu, Tongyu Li, Xiaolong Chen und Hangxiang Wang

Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory, 250117, Jinan, Provinz Shandong, VR China

Hangxiang Wang

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HW konzipierte und gestaltete Forschung; Xiaona Chen führte die meisten Experimente durch; FM, YX und Xiaolong Chen halfen bei der Recherche; Xiaona Chen, FM, YX, Xiaolong Chen, TL und HW analysierten Daten; Xiaona Chen und HW haben das Manuskript geschrieben und überarbeitet.

Korrespondenz mit Hangxiang Wang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, X., Meng, F., Xu, Y. et al. Chemisch programmierte STING-aktivierende nanoliposomale Vesikel verbessern die Immunität gegen Krebs. Nat Commun 14, 4584 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40312-y

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Eingegangen: 02. November 2022

Angenommen: 20. Juli 2023

Veröffentlicht: 31. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40312-y

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