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Sep 29, 2023

Schnelle metabolische Neuprogrammierung, vermittelt durch AMP

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 422 (2023) Diesen Artikel zitieren 2062 Zugriffe auf 17 Altmetric Metrics-Details Der allgegenwärtige Erreger Toxoplasma gondii hat einen komplexen Lebensstil mit

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 422 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der allgegenwärtige Erreger Toxoplasma gondii hat einen komplexen Lebensstil mit unterschiedlichen Stoffwechselaktivitäten in verschiedenen Stadien, die eng mit der parasitären Umgebung verknüpft sind. Hier haben wir den eukaryotischen Regulator der zellulären Homöostase, die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK), in Toxoplasma identifiziert und seine Rolle bei der Stoffwechselprogrammierung während des Lysezyklus des Parasiten entdeckt. Die katalytische Untereinheit AMPKα wird nach der Freisetzung intrazellulärer Parasiten in extrazelluläre Umgebungen schnell phosphoryliert und treibt den energieerzeugenden Katabolismus an, um die Motilität und Invasion der Parasiten in Wirtszellen voranzutreiben. Im Inneren der Wirtszellen wird die AMPKα-Phosphorylierung auf das Grundniveau reduziert, um ein Gleichgewicht zwischen Energieproduktion und Biomassesynthese zu fördern und eine robuste Parasitenreplikation zu ermöglichen. Die AMPKγ-Depletion hebt die AMPKα-Phosphorylierung auf und unterdrückt das Parasitenwachstum, das teilweise durch Überexpression von Wildtyp-AMPKα, jedoch nicht durch die Phosphorylierungsmutanten, gerettet werden kann. Durch die zyklische Neuprogrammierung durch AMPK werden die Stoffwechselbedürfnisse der Parasiten in jedem Stadium befriedigt und der Lysezyklus schreitet robust voran.

Veränderungen der Umweltbedingungen sind Herausforderungen, mit denen sich alle lebenden Organismen auseinandersetzen müssen. Aufgrund ihres einzigartigen Lebensstils sind parasitäre Organismen besonders gut darin, auf Umweltveränderungen zu reagieren und sich anzupassen. Toxoplasma gondii, ein allgegenwärtiges Protozoon, das ein Drittel der Weltbevölkerung und zahlreiche Tiere infiziert, kann unter äußerst unterschiedlichen Wirts- und Umweltbedingungen wachsen und überleben1,2. Dieser Parasit hat einen komplexen Lebenszyklus, der mehrere Stadien abwechselt, die für seine Pathogenese und Übertragung von entscheidender Bedeutung sind. Bei einer akuten Infektion von Zwischenwirten vermehren sich die Parasiten rasch als Tachyzoiten, die für die klinischen Symptome der Toxoplasmose3 verantwortlich sind. Tachyzoiten dringen aktiv in Wirtszellen ein, vermehren sich in ihnen und lysieren sie dann, um neue Invasionen zu starten, wenn die Parasitenzahl eine bestimmte Menge erreicht. Unter optimalen Bedingungen wachsen die Parasiten kontinuierlich als Tachyzoiten und wiederholen den Lysezyklus. Unter Stress- oder Hungerbedingungen können sich Tachyzoiten jedoch in eine weniger aktive Form, sogenannte Bradyzoiten, umwandeln, die in Gewebezysten eingeschlossen sind und eine lebenslange chronische Infektion im Wirt aufrechterhalten1,2,4.

Toxoplasma-Parasiten haben in verschiedenen Stadien unterschiedliche Stoffwechselaktivitäten. Die meisten glykolytischen Enzyme haben zwei Isoformen, von denen viele eine stadienspezifische Expression aufweisen5,6, was auf unterschiedliche Anforderungen an die glykolytische Aktivität in verschiedenen Stadien hinweist. In ähnlicher Weise reichern Bradyzoiten und Oozysten große Mengen Amylopektin an, was bei Tachyzoiten kaum vorkommt7,8,9. Die physiologische Bedeutung und die zugrunde liegenden Regulationsmechanismen für einen solchen stadienspezifischen Stoffwechsel sind weitgehend unbekannt. Der Lysezyklus von Tachyzoiten umfasst zwei Phasen: ein kurzes extrazelluläres Stadium, in dem frisch ausgewanderte Parasiten ihre Gleitbewegung nutzen, um Wirtszellen zu finden und in sie einzudringen, und ein intrazelluläres Stadium, in dem sich eingedrungene Parasiten innerhalb der Wirtszellen vermehren. Aus metabolischer Sicht besteht das Hauptziel extrazellulärer Tachyzoiten darin, genügend Energie zu erzeugen, um eine schnelle und effiziente Invasion voranzutreiben, wohingegen intrazelluläre Parasiten eine ausgewogene Energieproduktion und Makromolekülsynthese benötigen, um sich zu reproduzieren. Es wurde beobachtet, dass sich das glykolytische Enzym Fructose-Bisphosphat-Aldolase vom Zytoplasma in die Parasitenperipherie verlagert, sobald die Parasiten aus den Wirtszellen freigesetzt werden10. Da sich der Motorkomplex, der die Motilität des Parasiten antreibt, unter der Membran des Parasiten befindet, wurde angenommen, dass die Relokalisierung glykolytischer Enzyme eine Möglichkeit darstellt, schnell Energie an den Stellen zu erzeugen, an denen sie benötigt wird11. Darüber hinaus wurde bei der Behandlung von Tachyzoiten mit 13C-markierter Glucose zur Überwachung des Flusses von aus Glucose gewonnenem Kohlenstoff gezeigt, dass 13C zwar effizient in Makromoleküle wie Fettsäuren bei intrazellulären Parasiten eingebaut werden konnte, bei extrazellulären Parasiten jedoch kaum in solche Moleküle eingebaut wurde12. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass das extrazelluläre Stadium zwar sehr kurze Sekunden bis Minuten dauert, sich sein Stoffwechsel jedoch grundlegend von dem intrazellulärer Parasiten unterscheidet. Wie ein solcher kurzfristiger Stoffwechselübergang reguliert und erreicht wird, ist völlig unbekannt.

Die Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase unter verschiedenen Bedingungen ist der Schlüssel zum Leben aller Organismen. In Eukaryoten ist die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) ein entscheidender Regulator des Zellstoffwechsels, der dafür sorgt, dass die Stoffwechselaktivitäten in einer Zelle ihren Bedürfnissen entsprechen13,14. AMPK ist eine konservierte Serin/Threonin-Kinase, die aus drei Untereinheiten besteht, einer katalytischen Untereinheit α und zwei regulatorischen Untereinheiten β und γ. Es überwacht den Energiestatus in einer Zelle, indem es das Verhältnis von AMP zu ATP misst, und schaltet dann die energieerzeugenden oder -verbrauchenden Stoffwechselprogramme entsprechend ein oder aus15,16. AMPKγ enthält Cystathionin-β-Synthase (CBS)-Domänen, die AMP binden und es dem AMPK-Komplex somit ermöglichen, auf Änderungen des Energieniveaus zu reagieren17,18. Die Bindung von AMP an AMPKγ induziert die Phosphorylierung von AMPKα am T172-Rest (die Nummerierung der Reste basiert auf einem Ratten-AMPKα) und aktiviert die Kinaseaktivität von AMPKα18,19. Für die Regulierung der AMPK-Aktivität ist außerdem die β-Untereinheit (AMPKβ) erforderlich, die als struktureller Kern für den AMPK-Komplex fungiert, indem sie über ihre αγ-Untereinheit-Bindungssequenz (αγ-SBS) sowohl mit der α- als auch der γ-Untereinheit interagiert. Darüber hinaus spielen auch sein Kohlenhydratbindungsmodul (CBM) und posttranslationale Modifikationen wie Myristoylierung und Phosphorylierung eine Rolle bei der Abstimmung der Aktivität von AMPK20. Sobald AMPK aktiviert ist, initiiert es ein Netzwerk von Signalereignissen, die den Zellstoffwechsel neu programmieren, um Energie zu sparen. AMPK kann Zielenzyme wie Acetyl-CoA-Carboxylase phosphorylieren, um deren Aktivitäten zu modulieren13,14,19. Die transkriptionelle Regulierung der Zielgenexpression ist eine weitere Möglichkeit für AMPK, den Stoffwechsel und das Zellwachstum zu regulieren21. Hunderte von Zielen für AMPK wurden von Hefen bis zum Menschen identifiziert14,16,22. Abhängig von den Signalen stimmt AMPK die Aktivitäten mehrerer Ziele fein ab, um ein abgestimmtes Stoffwechselprogramm als Reaktion auf Umweltschwankungen zu erreichen.

Die regulatorischen Rollen von AMPK auf den Stoffwechsel und die zelluläre Homöostase werden ausführlich an Modell-Eukaryoten wie Arabidopsis, Hefen und Mäusen untersucht. Dennoch werden seine Funktionen in parasitären Organismen selten untersucht. AMPK-Komplexe wurden in Trypanosoma brucei und Trypanosoma cruzi23,24 identifiziert. In T. brucei wird AMPKα1 während der Differenzierung von der proliferativen Form bei Säugetieren zur Ruheform aktiviert, die für den Insektenvektor voradaptiert ist. Eine künstliche Stimulation oder Hemmung der AMPKα1-Aktivierung beeinflusst den Übergangsprozess erheblich, was darauf hindeutet, dass AMPK eine Rolle bei der Regulierung des Lebensstils dieses Parasiten spielt23.

In dieser Studie beschreiben wir den AMPK-Komplex in T. gondii und berichten über seine wesentliche Funktion für die Parasitenvermehrung. Toxoplasma kodiert für einen einzelnen kanonischen AMPK-Komplex, der aus drei Untereinheiten besteht. Die Phosphorylierung von Toxoplasma AMPKα ist bei intrazellulären Parasiten gering, wird jedoch bei extrazellulären Parasiten stark induziert, was zu einer zyklischen Aktivierung und Deaktivierung von AMPK während des Lysezyklus führt. Durch die Erzeugung und Charakterisierung einer AMPKγ-Depletionsmutante, die die AMPKα-Phosphorylierung beeinträchtigt hat, zeigen unsere Ergebnisse wichtige metabolische Umprogrammierungsfunktionen von AMPK während des Lysezyklus von Tachyzoiten.

Der kanonische AMPK-Komplex ist ein Heterotrimer, das aus einer α-Untereinheit, die eine aktive Kinase ist, und zwei regulatorischen Untereinheiten β und γ besteht, die die Aktivität von α22 regulieren. Um den AMPK-Komplex in T. gondii zu identifizieren, wurden AMPK-Untereinheiten aus Hefe und Mensch als Köder für die BLASTP-Suche in der Toxoplasma-Genomdatenbank (TGGT1 von ToxoDB Release 42) verwendet. Es wurden zwei Proteine ​​mit signifikanten Homologien zu menschlichem und Hefe-AMPKα identifiziert und als TgAMPKα (TGGT1_233905) bzw. TgKIN (TGGT1_291050) bezeichnet, die Kandidaten für AMPKα-Orthologe in Toxoplasma sind. Weitere Sequenzanalysen deuten darauf hin, dass TgAMPKα klassische Domänenstrukturen aufweist wie andere AMPKα-Proteine. Es verfügt über eine konservierte Kinasedomäne am N-Terminus, gefolgt von einer autoinhibitorischen Domäne und regulatorischen Motiven an der C-terminalen Region (Abb. 1a). TgKIN enthält auch eine Kinasedomäne. Es weist jedoch lange Verlängerungen in den N- und C-terminalen Regionen auf, die schlecht konserviert sind (Abb. 1a), ähnlich den KIN-Kinasen in Plasmodium-Arten, die anscheinend kein AMPKβ oder AMPKγ haben. Der Domänenstruktur nach zu urteilen, ist TgAMPKα wahrscheinlich das echte AMPKα-Ortholog in Toxoplasma, wohingegen TgKIN ortholog zu Plasmodium KIN ist und möglicherweise unabhängig von den AMPK-Untereinheiten funktioniert (weitere Beweise dafür werden unten beschrieben). BLAST-Suchen von ToxoDB identifizierten auch Proteine, die wahrscheinlich ortholog zu AMPKβ (TGGT1_268960, TgAMPKβ) und AMPKγ (TGGT1_239870, TgAMPKγ) von Mensch und Hefe sind, aber in beiden Fällen ist die Homologie auf kurze Regionen beschränkt (Abb. 1b, c). Das mutmaßliche TgAMPKβ enthält eine CBM-Domäne, die eine Sequenzidentität von 46 % mit der von menschlichem AMPKβ1 aufwies (Abb. 1b). In ähnlicher Weise enthält das mutmaßliche TgAMPKγ zwei CBS-Domänen, die häufig in AMPKγ vorkommen, und sie hatten eine Sequenzidentität von 21,7 % bzw. 15,2 % mit der ersten CBS-Domäne von menschlichem AMPKγ2 (Abb. 1c).

a–c-Domänenstrukturen der drei Untereinheiten von Toxoplama AMPK im Vergleich zu ihren entsprechenden Orthologen in anderen Eukaryoten. Zum Vergleich sind die Proteine ​​Mensch (Homo sapiens, Hs), Hefe (Saccharomyces cerevisiae, Sc) und Plasmodium (Pasmodium berghei, Pb) enthalten. Ein Sequenz-Alignment (durchgeführt von Clustal d-transgene Stämme, die TgAMPKα-Ty, TgAMPKβ-Ty oder TgAMPKγ-HA exprimieren, wurden einzeln in Co-IP-Experimenten (unter Verwendung von Antikörpern gegen die entsprechenden Epitop-Tags) verwendet, um Proteine ​​zu identifizieren, die mit jeder der Toxoplasma-AMPK-Untereinheiten interagieren. Ausgewählte Treffer aus diesen Co-IP-Experimenten, die durch Massenspektrometrie (MS) identifiziert wurden, wurden angezeigt und die Zahlen geben die Anzahl der einzigartigen Peptide an, die aus MS-Analysen abgeleitet wurden und mit den entsprechenden Treffern übereinstimmten. Alle diese Treffer wurden in den Kontrollexperimenten mit nicht markierten Elternstämmen nicht identifiziert und eine vollständige Liste der Treffer finden Sie in den Zusatzdaten 1. e Erkennung von TgAMPKα durch den monoklonalen Antikörper Phospho-AMPKα (Thr172), der phosphoryliertes HsAMPKα erkennt, wie durch bestimmt Western Blot auf gereinigten extrazellulären Parasiten (Toxoplasma) und Wirtszellen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den AMPK-Komplex in Toxoplasma weiter zu untersuchen, wurde ein Ty-markierter transgener Stamm RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-Ty konstruiert, in dem das endogene AMPKα durch ein Ty-markiertes AMPKα ersetzt wurde, das von einem pTub-Promotor exprimiert wurde (Abb. S1a – c). . Dieser Stamm wurde dann in einem Experiment mit Co-Immunpräzipitation (Co-IP, unter Verwendung des monoklonalen Ty-Antikörpers) und Massenspektrometrie (MS) verwendet, um nach Proteinen zu suchen, die mit AMPKα interagieren. Gemessen an der Anzahl der eindeutigen Peptide aus den MS-Ergebnissen war das mutmaßliche TgAMPKγ, das aus der bioinformatischen Analyse identifiziert wurde, der Top-1-Treffer dieser AMPKα-Ty-basierten Co-IP/MS (Abb. 1d und Tabelle S1). Im Kontrollexperiment mit dem nicht markierten Elternstamm RH wurden keine Peptide von TgAMPKγ gefunden. Ebenso gehörte auch das mutmaßliche AMPKβ zu den Top-10-Treffern (Abb. 1d und Tabelle S1). Um weiter zu bestätigen, dass diese Proteine ​​tatsächlich einen Komplex bilden, wurden die mutmaßlichen AMPKβ- und AMPKγ-Untereinheiten auch Co-IP/MS-Analysen unterzogen. Zu diesem Zweck wurden in den Co-IP-Experimenten die RH Δhxgprt/LoxP-AMPKβ-Ty-Stämme (die ein Ty-markiertes AMPKβ enthielten, Abb. S2) und die AMPKγ-mAID-Stämme (die ein HA-markiertes AMPKγ enthielten, wie unten beschrieben) verwendet. unter Verwendung von Anti-Ty- bzw. -HA-Antikörpern. Bei der Analyse der MS-Ergebnisse dieser Co-IP-Experimente wurden die mutmaßlichen TgAMPK-Untereinheiten immer als Top-Hits angezeigt (Abb. 1d und Tabelle S1), was darauf hindeutet, dass es sich um echte AMPK-Untereinheiten handelt, die den AMPK-Komplex in T. gondii bilden. Darüber hinaus identifizierten diese Co-IP-Experimente auch potenzielle Bindungspartner des Toxoplasma AMPK-Komplexes. Insbesondere die 63 Proteine, die in allen drei auf AMPK-Untereinheiten basierenden Co-IPs angereichert wurden, interagieren wahrscheinlich mit AMPK (Abb. S3, Tabelle S1 und ergänzende Daten 1). Andererseits identifizierte keines dieser Co-IPs TgKIN als Treffer, was darauf hindeutet, dass TgKIN wahrscheinlich eigenständig funktioniert und nicht mit einer der mutmaßlichen AMPK-Untereinheiten interagiert. Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass Toxoplasma-Tachyzoiten einen AMPK-Komplex bestehend aus TgAMPKα, TgAMPKβ und TgAMPKγ aufweisen.

Die Aktivität des AMPK-Komplexes wird durch Phosphorylierung eines spezifischen Threoninrests (T172 für Säugetier-AMPK) in der Aktivierungsschleife von AMPKα reguliert. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit in dieser Region (Abb. 1a) erkannte ein monoklonaler Antikörper, der mit phosphoryliertem menschlichem AMPKα an Threonin 172 reagiert, auch phosphoryliertes TgAMPKα in gereinigten extrazellulären Parasiten (Abb. 1e). Um weiter zu bestätigen, dass es sich bei dem von diesem Antikörper erkannten Parasitenprodukt tatsächlich um TgAMPKα handelt, fusionierten wir ein Mini-Auxin-induzierbares Degron (mAID) mit dem Carboxylterminus von endogenem TgAMPKα und konstruierten einen AMPKα-mAID-Stamm, dessen AMPKα nach Indol-3- Behandlung mit Essigsäure (IAA) (Abb. S4a). Wie erwartet verschwand das vom Anti-Phospho-AMPKα(Thr172)-Antikörper erkannte Produkt, nachdem die AMPKα-mAID-Parasiten mit IAA behandelt wurden (Abb. S4b), was zeigt, dass es sich bei dem erkannten Parasitenprodukt tatsächlich um TgAMPKα handelt.

Um die physiologische Rolle von AMPK in Toxoplasma zu beurteilen, haben wir zunächst ein Plasmid, das die Cre-Rekombinase exprimiert, in den oben beschriebenen Stamm RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-Ty eingeführt. Cre-Rekombinase induzierte die Exzision von AMPKα und aktivierte die Expression von YFP, was eine AMPKα-Deletion meldete (Abb. S1c). Wir haben versucht, nach der Transfektion des Cre-exprimierenden Plasmids einen sauberen YFP+ AMPKα--Klon zu erhalten, sind aber gescheitert, was darauf hindeutet, dass AMPKα für das Parasitenwachstum essentiell sein könnte. Ein weiterer Beleg für diese Annahme ist, dass die YFP+-Population im Pool (RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-TY, transfiziert mit Cre) 2 Tage nach der Cre-Einführung ihren Höhepunkt erreichte und dann allmählich abnahm und am 8. Tag auf nahezu Null sank (Abb. S1d), was darauf hindeutet AMPKα-Mutanten hatten schwere Wachstumsdefekte, so dass sie nicht mit den AMPKα+-Parasiten im Pool konkurrieren konnten. Dennoch ist es schwierig, dieses System zur Untersuchung der Rolle von TgAMPKα zu verwenden, da der Prozentsatz der YFP+ AMPKα-Parasiten nach der Cre-Transfektion (Abb. S1d) sehr niedrig war (<10 % selbst am Spitzenpunkt), was dies schwierig macht Erhalten Sie genügend AMPKα-Parasiten für die nachgelagerte Arbeit. Unterdessen war der oben erwähnte AMPKα-mAID-Stamm auch nicht ideal für die funktionelle Beurteilung von AMPKα, da die IAA-Behandlung zwar das Parasitenwachstum reduzierte, es jedoch nicht zum Stillstand brachte, wie dies bei den vom loxP-AMPKα/Cre-System abgeleiteten YFP+ AMPKα-Parasiten der Fall war. Dies ist wahrscheinlich auf den unvollständigen Abbau von AMPKα durch IAA zurückzuführen. Alternativ entschieden wir uns, uns auf die γ-Untereinheit zu konzentrieren und nutzten genetische Ansätze, um ihre biologischen Funktionen zu analysieren. In anderen Modellorganismen erkennt AMPKγ Veränderungen im Zellstoffwechsel und ist wichtig für die Regulierung der Kinaseaktivität von AMPKα25,26. Daher ist AMPKγ der Schlüssel für die Aktivität des AMPK-Komplexes und wir haben uns auf AMPKγ konzentriert, um die Rolle von AMPK bei Toxoplasma-Parasiten zu beurteilen. Wir haben zunächst AMPKγ für die direkte Gendeletion ins Visier genommen, indem wir CRISPR/Cas9-unterstützten homologen Genersatz eingesetzt haben. Allerdings gelang es trotz mehrfacher Versuche nicht, dieses Gen auszuschalten, was darauf hindeutet, dass AMPKγ eine entscheidende Rolle für das Parasitenwachstum spielt. Dann wechselten wir zu einem bedingten Depletion-Ansatz, indem wir ein mAID an den Carboxylterminus von AMPKγ am endogenen Genort im Tir1-exprimierenden Stamm RH ∆hxgprt Tir127 anfügten (Abb. S5a). Der resultierende AMPKγ-mAID-Stamm wurde durch diagnostische PCRs bestätigt (Abb. S5b) und die Zugabe von IAA zum Kulturmedium induzierte einen effizienten Abbau von AMPKγ, wie durch Immunfluoreszenztests (Abb. 2a) und Western Blot (Abb. S5c) nachgewiesen wurde. Die AMPKγ-Depletion unterdrückte das Parasitenwachstum, was durch die fehlende Plaquebildung der mit IAA behandelten AMPKγ-mAID-Parasiten in HFF-Monoschichten gezeigt wurde (Abb. 2b, c). Detaillierte Analysen legten nahe, dass der AMPKγ-Abbau globale Auswirkungen auf den Lysezyklus von Parasiten hatte. Die Effizienz der intrazellulären Replikation (Abb. 2d), der Gleitmotilität (Abb. 2e) und der Invasion der Wirtszellen (Abb. 2f) war nach dem AMPKγ-Abbau alle verringert. Der Einfluss der AMPKγ-Depletion auf diese Parasitenaktivitäten ist wahrscheinlich indirekt, da der AMPKγ-Abbau durch IAA innerhalb von 30 Minuten induziert werden konnte (Abb. 2a), die Invasionsdefekte jedoch erst 24 Stunden nach der IAA-Behandlung auftraten (Abb. 2f).

a Abreicherung von TgAMPKγ im AMPKγ-mAID-Stamm durch IAA-Behandlung, bestimmt durch IFA an intrazellulären Parasiten, die mit oder ohne IAA behandelt wurden. Der Anti-HA-Antikörper wurde zur Untersuchung des AMPKγ-Spiegels verwendet und TgALD wurde als zytoplasmatischer Marker verwendet. b Fehlendes Parasitenwachstum nach TgAMPKγ-Depletion, bestimmt durch Plaque-Assays mit oder ohne IAA-Behandlung für 7 Tage. c Relative Größen von Plaques (ausgedrückt als Pixeleinheiten bei Berechnung mit Adobe Photoshop), abgeleitet aus b. Für jede Erkrankung wurden mehr als 90 Plaques bestimmt und die Daten werden als Violindiagramme (Median mit Interquartilbereich) grafisch dargestellt. ****P < 0,0001, NS (p = 0,1604): nicht signifikant, ungepaarter zweiseitiger Student-T-Test. d Intrazelluläre Replikationsraten der angegebenen Stämme mit oder ohne IAA-Behandlung, bestimmt durch die Verteilung parasitophorer Vakuolen (PVs), die 1, 2, 4, 8 oder 16 Parasiten enthalten, nach 24 Stunden intrazellulärem Wachstum. Mittelwerte ± SEM von n = 3 unabhängigen Experimenten, jedes mit zwei technischen Replikaten, Zwei-Wege-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichen nach den Tests. e Die Länge der Spuren, die von extrazellulären Parasiten gebildet werden, die auf einer mit Rinderalbumin beschichteten Oberfläche gleiten. Die Parasiten wurden 48 Stunden lang mit oder ohne IAA vorbehandelt, mechanisch von den Wirtszellen freigesetzt und zum Gleiten auf mit Rinderalbumin vorbeschichteten Deckgläsern verwendet. Die durch das Gleiten des Parasiten gebildeten Spuren wurden von IFA mithilfe eines Antikörpers gegen das Oberflächenprotein SAG1 bestimmt. Über 150 Gleitpfade aus n = 3 unabhängigen Experimenten (jedes enthielt 49 bis 67 Pfade) wurden für jede Bedingung analysiert und als Violindiagramme (Median mit Interquartilbereich) grafisch dargestellt. ***P < 0,001, ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test. f Invasionseffizienzen des AMPKγ-mAID-Stammes, der während der intrazellulären Wachstumsphase 0, 12, 24, 48 oder 72 Stunden lang mit IAA vorbehandelt wurde. Vorbehandelte Parasiten wurden gereinigt und 20 Minuten lang zum Eindringen in HFF-Zellen verwendet. Anschließend wurde ein Zweifarben-Färbetest verwendet, um eingedrungene Parasiten von nicht eingedrungenen zu unterscheiden. Die Invasionseffizienz unbehandelter Parasiten (0 h) wurde auf 100 % gesetzt und zur Normalisierung der Invasionseffizienz IAA-behandelter Parasiten verwendet. Mittelwerte ± SD von n = 3 unabhängigen Experimenten, ****P < 0,0001, ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test, jedes wurde mit der 0-Stunden-Gruppe verglichen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um weiter zu bestätigen, dass Wachstumsdefekte der IAA-behandelten AMPKγ-mAID-Mutante durch das Fehlen von AMPKγ verursacht werden, wurde ein Komplementationsstamm (Comp-γ) konstruiert, der ein Ty-markiertes AMPKγ aus dem UPRT-Locus des AMPKγ-mAID-Stammes exprimiert (Abb. S6a). Diagnostische PCRs bestätigten die korrekte Integration des Komplementationskonstrukts. IFA und Western Blot stellten beide die Expression des komplementären AMPKγ sicher (Abb. S6b – d). Im Gegensatz zum AMPKγ-mAID-Stamm, der in Gegenwart von IAA nicht wuchs, stellte die AMPKγ-Komplementierung das Parasitenwachstum vollständig wieder her und die IAA-Behandlung hatte keinen Einfluss auf die Plaquebildung des Comp-γ-Stamms (Abb. S6e), was darauf hindeutet, dass tatsächlich ein AMPKγ-Mangel vorliegt verantwortlich für den Wachstumsstopp der IAA-behandelten AMPKγ-mAID-Mutante.

Die Phosphorylierung des T172-Restes (oder eines Äquivalents) ist der Schlüssel zur Regulierung der Aktivität kanonischer AMPK-Komplexe. Da der Abbau von TgAMPKγ bei Parasiten tödlich ist, wollten wir seinen Einfluss auf die AMPKα-Phosphorylierung bestimmen. Bei der Untersuchung mechanisch freigesetzter extrazellulärer Parasiten durch Western Blot unter Verwendung des Phospho-AMPKα(Thr172)-Antikörpers wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von TgAMPKα am T221-Rest (entsprechend T172 bei Säugetieren) nach der AMPKγ-Depletion aufgehoben war, der Proteingehalt von TgAMPKα jedoch nicht betroffen (Abb. 3a). Die Reduzierung der TgAMPKα-Phosphorylierung wurde durch AMPKγ-Komplementierung vollständig wiederhergestellt (Abb. S7), was bestätigt, dass TgAMPKγ für die Phosphorylierung von TgAMPKα essentiell ist.

Eine TgAMPKα-Phosphorylierung ist bei TgAMPKγ-depletierten Parasiten aufgehoben. Die 48 Stunden lang mit oder ohne IAA vorbehandelten AMPKγ-mAID-Parasiten wurden gezwungen, die Wirtszellen zu verlassen, und wurden dann durch Western Blots analysiert, wobei Antikörper verwendet wurden, die phosphoryliertes AMPKα, Gesamt-TgAMPKα oder TgGRA1 erkannten. b Die TgAMPKα-Phosphorylierung wird in extrazellulären Parasiten im Wildtyp-Stamm RH induziert. Intrazelluläre Parasiten (intakte PV, die in Wirtszellen enthalten sind) oder mechanisch freigesetzte Parasiten, die 0 oder 30 Minuten lang in einer extrazellulären Umgebung inkubiert wurden, wurden durch Western Blot untersucht. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um nach Bedingungen zu suchen, die den Phosphorylierungsstatus von TgAMPKα verändern, wurde festgestellt, dass die Freisetzung intrazellulärer Parasiten in extrazelluläre Umgebungen die TgAMPKα-Phosphorylierung induzierte. Wenn intrazelluläre Parasiten (Proben enthielten Wirtszellen mit intakten parasitophoren Vakuolen) einer Western-Blot-Analyse mit dem Phospho-AMPKα(Thr172)-Antikörper unterzogen wurden, konnte die TgAMPKα-Phosphorylierung kaum nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde die TgAMPKα-Phosphorylierung schnell und dramatisch induziert, wenn infizierte Wirtszellen durch eine 22-Gauge-Nadel geleitet wurden, um die Wirtszellen zu lysieren und die Parasiten in das Kulturmedium freizusetzen (Abb. 3b). Die Inkubation der mechanisch freigesetzten Parasiten in der extrazellulären Umgebung über einen längeren Zeitraum führte offensichtlich nicht zu einer weiteren Steigerung der TgAMPKα-Phosphorylierung. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die Freisetzung von Parasiten aus Wirtszellen in extrazelluläre Umgebungen ein starkes Signal zur Aktivierung der TgAMPKα-Phosphorylierung ist.

Die verringerte Phosphorylierung von TgAMPKα bei AMPKγ-Abbau veranlasste uns zu prüfen, ob die Änderung der TgAMPKα-Phosphorylierung für die Wachstumsdefekte des AMPKγ-abgereicherten Mutanten verantwortlich war. Zu diesem Zweck haben wir drei verschiedene Allele von TgAMPKα, die unterschiedliche Phosphorylierungszustände nachahmen, in die AMPKγ-mAID-Mutante eingeführt (Abb. 4a). Das T221D-Allel ahmt die Phosphorylierung nach, während T221A einen Phosphorylierungsdefekt aufweist. Als Kontrolle wurde das Wildtyp-T221T-Allel einbezogen. Diese verschiedenen Allele von TgAMPKα wurden einzeln in den UPRT-Locus des AMPKγ-mAID-Stammes eingefügt und in ähnlichen Mengen exprimiert (Abb. 4b). Der Einfluss dieser AMPKα-Allele auf das Wachstum des AMPKγ-bedingten Depletionsstamms wurde durch Plaque-Assays abgeschätzt. Ohne IAA-Behandlung reduzierte die Expression von TgAMPKα-T221D und TgAMPKα-T221A in AMPKγ-mAID das Parasitenwachstum geringfügig, aber signifikant, was durch kleinere Plaques angezeigt wird (Abb. 4c, d). Andererseits hatte die Expression einer zweiten Kopie von TgAMPKα (dem T221T-Allel) keinen offensichtlichen Einfluss (Abb. 4c, d). Wenn IAA verwendet wurde, um den AMPKγ-Abbau zu induzieren, verbesserten weder TgAMPKα-T221D noch TgAMPKα-T221A das Wachstum der AMPKγ-abgereicherten Mutanten, da selbst nach 15 Tagen Wachstum keine sichtbaren Plaques nachgewiesen wurden. Andererseits ermöglichte die Expression von TgAMPKα-T221T (Wildtyp-TgAMPKα) die Plaquebildung in Gegenwart von IAA (Abb. 4c, d), was auf eine robuste Rettung von AMPKγ-depletierten Mutanten durch TgAMPKα schließen lässt.

a Schematische Darstellung der Expression der TgAMPKα-T221T-, -T221D- oder -T221A-Allele in Parasiten, denen TgAMPKγ fehlt, was durch IAA-Behandlung der AMPKγ-mAID-Mutante erreicht wurde. Die AMPKα-Expressionskassette wurde in den UPRT-Locus des AMPKγ-mAID-Stammes eingefügt, um ähnliche Expressionen für verschiedene AMPKα-Allele zu erreichen. b Expressionsniveaus der TgAMPKα-T221T/D/A-Allele in AMPKγ-mAID, bestimmt durch Western Blot gegen den mit TgAMPKα fusionierten Ty-Tag. TgALD wurde als Ladungskontrolle einbezogen. c Plaque-Assays zur Beurteilung des Gesamtwachstums der AMPKγ-mAID-Mutante, die verschiedene Allele von TgAMPKα exprimiert, mit oder ohne IAA-Behandlung für 7 oder 15 Tage. d Von c abgeleitete Größen der Plaques, ausgedrückt als Pixeleinheiten bei der Berechnung mit Adobe Photoshop. Mittelwerte ± SD von n ≥ 79 Plaques für jede Erkrankung. ****P < 0,0001, NS: nicht signifikant, ungepaarter zweiseitiger Student-T-Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die unterschiedlichen Fähigkeiten von TgAMPKα-Allelen, das Wachstum von AMPKγ-depletierten Mutanten zu retten, ermöglichten es uns zu untersuchen, wie sich die AMPKα-Phosphorylierung auf die Aktivitäten von Parasiten auswirkt. Die oben beschriebenen Plaque-Assays beurteilen die allgemeine Fitness der Parasiten. Defekte in irgendeinem Schritt des Lysezyklus, wie etwa Invasion und Replikation, würden zu Veränderungen in der Plaquebildung führen. Um den Einfluss der AMPKα-Phosphorylierung auf jeden dieser Schritte zu untersuchen, überprüften wir zunächst die Effizienz der intrazellulären Replikation, indem wir die Anzahl der Parasiten in den PVs bestimmten. Ohne IAA-Behandlung hatte die Expression von T221T oder T221D von TgAMPKα nur geringe Auswirkungen auf die Parasitenproliferation, wohingegen T221A die Proliferation leicht reduzierte (Abb. 5a). Bei Behandlung mit IAA zur Abreicherung von AMPKγ erhöhte die Expression von TgAMPKα-T221T die Replikationsraten des Parasiten signifikant (im Vergleich zu AMPKγ-mAID, das mit IAA behandelt wurde), während dies bei T221D oder T221A nicht der Fall war (Abb. 5a). Die Expression des T221A-Allels reduzierte tatsächlich die Replikation von AMPKγ-depletierten Mutanten (Abb. 5a). Wenn andererseits die Effizienz der Invasion von Wirtszellen durch einen 20-minütigen Invasionstest getestet wurde, konnten sowohl die T221T- als auch die T221D-Allele die Invasionsdefekte von AMPKγ-depletierten Mutanten vollständig wiederherstellen. Im Gegensatz dazu verringerte das T221A-Allel die Invasionseffizienz weiter, anstatt sie zu verbessern (Abb. 5b), was auf einen dominanten negativen Effekt dieses Allels schließen lässt. Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass das T221T-Allel von TgAMPKα die Invasion der Wirtszellen wiederherstellte und die Rate der intrazellulären Replikation verbesserte. Daher konnte das Wachstum von AMPKγ-depletierten Mutanten teilweise gerettet werden. Das T221D-Allel stellte die Invasion, aber nicht die Replikation wieder her, während T221A keines von beiden bewirkte, was ihre Unfähigkeit erklärt, das Wachstum zu retten.

Alle Experimente wurden n = 3 (a–c) oder n = 4 (d) Mal unabhängig voneinander wiederholt und die Mittelwerte ± SEM sind grafisch dargestellt. ***P = 0,0004, ****P < 0,0001, zweiseitige ANOVA mit mehreren Tukey-Vergleichen nach den Tests (a), ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test (b–d). Die Replikations- und Invasionstests wurden wie in Abb. 2d und f durchgeführt. Der ATP-Spiegel wurde mit einem kommerziellen Luciferase-Assay unter Verwendung von Lysaten gemessen, die aus 5 × 106 mechanisch freigesetzten frischen Parasiten hergestellt wurden, die 48 Stunden lang mit oder ohne IAA behandelt wurden. Die Aktivität der entstehenden Proteinsynthese wurde durch Zugabe von L-Homopropargylglycin, einem Alkin-markierten Analogon von Methionin, zu Parasiten bestimmt, die mit oder ohne IAA behandelt wurden. Anschließend wurde das eingebaute L-Homopropargylglycin durch einen Click-Chemie-Ansatz unter Verwendung der Fluoreszenzsonde FAM-Azid nachgewiesen und durch Durchflusszytometrieanalysen quantifiziert. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Eine Schlüsselfunktion des AMPK-Komplexes ist die Regulierung der metabolischen Homöostase. Um den Einfluss der AMPKγ-Depletion und der anschließenden Expression von TgAMPKα-Allelen auf den Energiestatus von Parasiten zu überprüfen, wurden die zellulären ATP-Spiegel mithilfe eines auf Firefly-Luciferase basierenden ATP-Biolumineszenz-Assay-Kits geschätzt. Die 48-stündige Behandlung der AMPKγ-mAID-Parasiten mit IAA reduzierte den ATP-Spiegel um 73,8 % ± 1,8 % (Abb. 5c). Darüber hinaus verstärkte sich die Abnahme des zellulären ATP mit zunehmender Zeit der IAA-Behandlung (Abb. S8), was darauf hindeutet, dass der ATP-Abfluss nach der AMPKγ-Abnahme zeitlich kumulativ ist. Die Expression des Wildtyps oder der mutierten Formen von TgAMPKα veränderte die ATP-Spiegel in Abwesenheit von IAA nicht signifikant. Mit der IAA-Behandlung stellte das T221D-Allel von TgAMPKα den zellulären ATP-Spiegel signifikant wieder her, wenn auch nicht auf dem Niveau bei Wildtyp-Parasiten (Abb. 5c). Die Expression von TgAMPKα-T221T erhöhte auch den ATP-Spiegel in TgAMPKγ-Depletionsmutanten, der Anstieg ist jedoch aufgrund der hohen Variation zwischen den Experimenten während der ATP-Quantifizierung statistisch nicht signifikant (Abb. 5c). Im Gegensatz dazu verringerte die Expression des T221A-Allels den ATP-Spiegel weiter, was mit einem dominanten negativen Effekt dieser Mutante übereinstimmt (Abb. 5c). Interessanterweise stimmt die Wirkung verschiedener TgAMPKα-Allele auf die zellulären ATP-Spiegel gut mit der Wirkung auf die Invasionseffizienz entsprechender Stämme überein. Während bekannt ist, dass AMPK katabole und anabole Aktivitäten reguliert, um eine Energiehomöostase zu erreichen, haben wir auch die Makromolekülsyntheseaktivität der TgAMPKγ-Depletionsmutanten am Beispiel der entstehenden Proteinsynthese untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Click-Chemie-Ansatz verwendet, der den Einbau eines Alkin-markierten Analogons von Methionin (L-Homopropargylglycin) in neu synthetisierte Proteine ​​nachweist. Die AMPKγ-Depletion durch IAA-Behandlung des AMPKγ-mAID-Stammes reduzierte die Synthese entstehender Proteine ​​um 42,0 % ± 8,7 % (Abb. 5d). Interessanterweise führte die Expression von AMPKα-T221D auch ohne IAA-Behandlung zu einer geringeren Proteinsyntheseaktivität, wohingegen AMPKα-T221A oder AMPKα-T221T keinen solchen Effekt hatten (Abb. 5d). In Gegenwart von IAA verbesserte die Expression von AMPKα-T221D oder AMPKα-T221A im AMPKγ-mAID-Stamm seine Proteinsyntheseraten nicht (Abb. 5d). Andererseits erhöhte die Expression von AMPKα-T221T die Proteinsyntheseaktivität auf ein Niveau, das bei AMPKγ-mAID vor der IAA-Behandlung ähnlich war (Abb. 5d), obwohl dieser Anstieg bei einem p-Wert von normalerweise nicht als statistisch signifikant angesehen wurde 0,1039. Die unterschiedlichen Auswirkungen von AMPKα-Allelen auf die ATP-Produktion und Proteinsyntheseaktivitäten von AMPKγ-depletierten Parasiten legen nahe, dass der Phosphorylierungsstatus von AMPKα einen signifikanten Einfluss auf den Parasitenstoffwechsel hatte.

Die oben genannten Ergebnisse aus genetischen Studien zeigten die Schlüsselrolle der TgAMPKα-Phosphorylierung bei der Regulierung der Parasitenaktivitäten und des Stoffwechsels während des Lysezyklus. Um die Rolle von AMPK weiter zu untersuchen, verwendeten wir einen chemisch-genetischen Ansatz, der den Einsatz zweier weit verbreiteter Verbindungen zur Aktivierung bzw. Hemmung von AMPK beinhaltete. A769662 wurde aufgrund seiner starken und direkten Aktivierung von Säugetier-AMPK als Aktivator verwendet, während Verbindung C (Dorsomorphin-Dihydrochlorid) als Inhibitor verwendet wurde. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass diese Verbindungen auf die AMPK des Wirts abzielen, um die Parasitenaktivitäten zu beeinflussen, verwendeten wir eine embryonale Fibroblastenzelllinie (MEF) der Maus, deren AMPKα1 und AMPKα2 beide gestört waren28. Die Behandlung intrazellulärer Toxoplasma-Parasiten mit A769662 oder Verbindung C verringerte ihre Replikation in MEF-Zellen, denen AMPKα fehlt (Abb. 6a). Die hemmende Wirkung von Verbindung C war deutlich stärker als die von A769662 und die behandelten Parasiten vermehrten sich kaum (Abb. 6a). Beim Vergleich der Invasionseffizienz extrazellulärer Parasiten hingegen erhöhte die einstündige Behandlung von Parasiten mit A769662 die Effizienz der Wirtszellinvasion um 46,8 % ± 10,3 %. Im Gegensatz dazu verringerte die Behandlung mit Verbindung C die Invasionseffizienz auf 53,7 % ± 19,8 % derjenigen, die keine Behandlung erhielten (Abb. 6b). Diese Ergebnisse stimmen mit den oben genannten Daten aus genetischen Studien überein und untermauern weiter, dass die AMPK-Aktivierung die Invasion extrazellulärer Parasiten beschleunigt und das Fortschreiten des Lysezyklus eine dynamische AMPK-Aktivierung erfordert.

ein intrazellulärer Replikationstest von RH in Gegenwart der angegebenen Behandlungen, wie in Abb. 2d durchgeführt. Eingedrungene Parasiten konnten sich 24 Stunden lang in MEF-Zellen vermehren, denen sowohl AMPKα1 als auch AMPKα2 fehlten. Mittelwerte ± SEM von n = 3 unabhängigen Experimenten, ****P < 0,0001, *P = 0,0201, Zwei-Wege-ANOVA mit Tukeys Mehrfachvergleichen nach den Tests. b Effizienz der Wirtszellinvasion, bestimmt durch einen Zweifarbentest, der eingedrungene und nicht eingedrungene Parasiten unterschied. Die RH-Parasiten wurden vor dem Austritt eine Stunde lang mit den angegebenen Chemikalien behandelt. Dann wurden sie durch Nadelpassage freigesetzt und gereinigte Parasiten wurden verwendet, um HFF-Zellen 10 Minuten lang in Gegenwart der entsprechenden Verbindungen zu infizieren. Anschließend wurde die Anzahl der befallenen Parasiten durch das IFA ermittelt. Die Invasionseffizienz wurde als Anzahl der eingedrungenen Parasiten dividiert durch die Anzahl der Wirtszellen aufgetragen. Mittelwerte ± SD von n = 3 unabhängigen Experimenten, *P = 0,0103, **P = 0,0015, ungepaarter zweiseitiger Student-t-Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Transkriptionsregulation und posttranslationale Modifikation von Zielen sind zwei gängige Strategien, die AMPK zur Regulierung zellulärer Aktivitäten anwendet. Um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die dem schlechten Wachstum und dem beeinträchtigten Stoffwechsel der AMPKγ-depletierten Mutanten zugrunde liegen, haben wir zunächst die Genexpressionsänderungen der Parasiten bei der AMPKγ-Depletion überprüft. RNA-seq-Analysen zeigten, dass die AMPKγ-Depletion einen geringen Einfluss auf die Genexpression des Parasiten hatte. Nur 61 Gene erfüllten unsere Kriterien für das Aufrufen unterschiedlich exprimierter Gene, von denen 40 Gene in der AMPKγ-Depletionsmutante hochreguliert und 21 herunterreguliert waren (Abb. S9, Zusatzdaten 2).

Der Abbau von AMPKγ führt zu einer dramatischen Verringerung der AMPKα-Phosphorylierung, die für die Kinaseaktivität von AMPK von entscheidender Bedeutung ist. Daher wollten wir die Veränderung der Proteinphosphorylierung in Parasiten nach AMPKγ-Depletion bestimmen. Extrazelluläre Parasiten des AMPKγ-mAID-Stammes, die 48 Stunden lang mit oder ohne IAA vorbehandelt wurden, wurden proteomischen bzw. phosphoproteomischen Analysen unterzogen, um die Veränderungen der Proteinhäufigkeit und des Phosphorylierungsstatus einzelner Proteine ​​zu bewerten. Quantitative Proteomik identifizierte 47 Proteine, deren Häufigkeit um mehr als das 1,5-fache verändert war (p <0,05), von denen 24 verringert und 23 nach AMPKγ-Depletion erhöht waren (Abb. S10, Zusatzdaten 3). Andererseits veränderte sich die Häufigkeit von 325 Phosphopeptiden nach der AMPKγ-Depletion um mehr als das 1,5-fache. Nach Anpassungen an die Änderungen des Proteinspiegels (um auszuschließen, dass die Änderung der Phosphopeptidhäufigkeit durch Veränderungen des Proteinspiegels verursacht wurde) wurde die Häufigkeit von 285 Phosphopeptiden, die 170 Proteinen entsprechen, durch AMPKγ um mehr als das 1,5-fache (p < 0,05) verändert Erschöpfung (Ergänzungsdaten 4). Mehr als 40 % (74/170 = 43,5 %) dieser Proteine ​​sind hypothetische Proteine ​​mit unbekannten Funktionen. Darüber hinaus wurde eine große Anzahl von Proteinen mit Stoffwechselfunktionen, darunter Enzyme, Transporter und Regulatoren, in den AMPKγ+- und AMPKγ--Parasiten unterschiedlich phosphoryliert. Bemerkenswert ist, dass die glykolytischen Enzyme Pyruvatkinase 1 (PYK1) und Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase (ALD) sowie der Hauptglukoseimporter Glukosetransporter 1 (GT1) alle zwei oder mehr Phosphopeptide enthielten, zwischen denen sich die Häufigkeit unterschied AMPKγ exprimierende und abgereicherte Parasiten (Abb. 7a). Andere Proteine, die am Zuckerabbau oder Energiestoffwechsel beteiligt sind, darunter 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase (6PGD), Acetyl-Coenzym-A-Synthetase (ACS) und Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase, zeigten beim AMPKγ-Abbau ebenfalls Veränderungen in der Phosphorylierung an bestimmten Serinresten (Abb. 7a, Ergänzende Daten). 4). In ähnlicher Weise zeigten auch eine Reihe von Proteinen und Enzymen, die am Anabolismus beteiligt sind, wie z. B. die Lipid- und Proteinsynthese, Phosphorylierungsänderungen nach AMPKγ-Depletion (Abb. 7b, Zusatzdaten 4). Insbesondere die Phosphorylierung von drei eukaryotischen Initiationsfaktoren (eIF2B, eIF4A und eIF4G), die die Initiierung der Proteintranslation steuern, wurde beim AMPKγ-Abbau reduziert (Abb. 7b), was mit der beeinträchtigten Synthese von entstehenden Proteinen von AMPKγ-depletierten Parasiten übereinstimmt (Abb. 5d).

Veränderung der Phosphorylierung ausgewählter Zuckerkatabolismusproteine ​​(a) und Biomassesyntheseproteine ​​(b) an angegebenen Positionen nach dem TgAMPKγ-Abbau, bestimmt durch Phosphoproteomik an nadelfreigesetzten AMPKγ-mAID-Parasiten, die 48 Stunden lang mit oder ohne IAA vorbehandelt wurden. Extrahierte Parasitenproteine ​​aus n = 3 Sätzen unabhängiger Proben (jeder Satz enthielt eine Probe für mit IAA behandelte Parasiten und eine für nicht behandelte Parasiten) wurden mit Trypsin verdaut und mit sechs Plex Tandem Mass Tags (TMT) markiert. Anschließend wurden Phosphopeptide mit TiO2 und IMAC angereichert und mittels LC-MS/MS quantifiziert. Die Häufigkeitsänderung (ausgedrückt als log2-fache Änderung) und der entsprechende p-Wert (bestimmt durch zweiseitige empirische Bayes-Tests im Limma-Paket) (ausgedrückt als -Lg-p-Wert) jedes Phosphopeptids nach TgAMPKγ-Depletion (+IAA). /-IAA) wurden aufgezeichnet. Jede Bedingung wurde n = 3 Mal unabhängig getestet. GT1-Glukosetransporter 1, ACS Acetyl-Coenzym-A-Synthetase, ALD-Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase, PYK1-Pyruvatkinase 1, PDK-Pyruvatdehydrogenasekinase, 6PGD 6-Phosphogluconatdehydrogenase, eIF-eukaryotischer Initiationsfaktor, CEPT-Cholin/Ethanolamin-Phosphotransferase, FAAL Fettacyl-AMP-Ligase.

AMPK als Energiesensor und Schlüsselregulator des Stoffwechsels ist in fast allen Eukaryoten weit verbreitet und wurde ausführlich in Modellorganismen wie Hefen und menschlichen Zellen untersucht13,16. Dennoch ist wenig über seine Funktionen in parasitären Organismen bekannt, die einen einzigartigen Lebensstil haben, der einer ausgeklügelten Regulierung bedarf. Hier haben wir einen AMPK-Komplex im obligat intrazellulären Parasiten Toxoplasma gondii identifiziert, der ein Modell zur Untersuchung der komplexen Biologie apikomplexer Parasiten darstellt. Wir konzentrierten uns auf die γ-Untereinheit des Toxoplasma-AMPK-Komplexes und berichteten, dass eine intakte AMPK für das Wachstum dieses Parasiten wesentlich ist. Die bedingte Erschöpfung von TgAMPKγ führte zu einer verringerten Motilität, Invasion und intrazellulären Replikation des Parasiten (Abb. 2). Noch wichtiger ist, dass festgestellt wurde, dass die Phosphorylierung von TgAMPKα am T221-Rest (und damit die Aktivierung des AMPK-Komplexes) stark induziert wurde, wenn die Parasiten aus den Wirtszellen austraten und in die extrazelluläre Umgebung freigesetzt wurden. Die TgAMPKγ-Depletion hob die TgAMPKα-Phosphorylierung auf (Abb. 3). Durch die Überexpression von TgAMPKα-Allelen, die unterschiedliche Phosphorylierungszustände in der TgAMPKγ-Depletionsmutante nachahmen, deuten unsere Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle von AMPK bei der Neuprogrammierung der Stoffwechselaktivitäten des Parasiten während des Lysezyklus von Toxoplasma hin. Wenn Tachyzoiten aus Wirtszellen austreten, wird TgAMPKα phosphoryliert und aktiviert, um den Katabolismus zu steigern und den Anabolismus zu unterdrücken, wodurch die Parasiten die ATP-Produktion für eine effiziente Motilität und Invasion maximieren können. Denn im extrazellulären Stadium ist die Biomassesynthese begrenzt und die wichtigste Aufgabe besteht darin, geeignete Wirtszellen zu finden und in diese einzudringen, was viel Energie erfordert. Nach erfolgreicher Invasion und wenn die Parasiten intrazellulär sind, besteht das Hauptziel darin, sich selbst zu reproduzieren. Dadurch wird die TgAMPKα-Phosphorylierung auf das Grundniveau reduziert und der durch die Energieproduktion verzerrte Stoffwechsel in extrazellulären Parasiten wird auf einen ausgeglicheneren Stoffwechsel der Energieerzeugung und Biomassesynthese umgestellt, wodurch sich die Parasiten effizient vermehren können (Abb. 8). In Übereinstimmung mit diesem Modell reduzierten sowohl der AMPK-Inhibitor als auch der Aktivator zwar die Parasitenreplikation, ihre Auswirkungen auf die Invasion waren jedoch unterschiedlich. Der Aktivator erhöhte die Effizienz der Invasion, während der Inhibitor sie verringerte (Abb. 6).

Die Freisetzung intrazellulärer Parasiten in die extrazelluläre Umgebung induziert die AMPKα-Phosphorylierung, die den Katabolismus zur Energieerzeugung aktiviert und den Anabolismus unterdrückt. Im extrazellulären Stadium ist die Aktivität der Biomassesynthese gering, aber die Parasiten benötigen ausreichend Energie, um ihre Beweglichkeit für eine effiziente Invasion in Wirtszellen anzutreiben. Nach der Internalisierung in Wirtszellen wird die Phosphorylierung von AMPKα reduziert und ein Gleichgewicht zwischen Energie erzeugendem Katabolismus und Biomasse synthetisierendem Anabolismus wird erreicht, was eine robuste Proliferation der Parasiten ermöglicht.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass es in Toxoplasma nur einen AMPK-Komplex gibt und jede Untereinheit von einem Gen kodiert wird. Dies unterscheidet sich von anderen Organismen wie Hefen und Menschen16,22. Hefen haben eine α-Untereinheit Snf1, eine γ-Untereinheit Snf4 und drei β-Untereinheiten (Sip1, Sip2 und Gal83). Der Mensch hingegen hat zwei α-Untereinheiten (α1 und α2), zwei β-Untereinheiten (β1 und β2) und drei γ-Untereinheiten (γ1, γ2 und γ3). Diese Untereinheiten können unterschiedliche heterotrimere Kombinationen bilden, um unterschiedliche AMPK-Komplexe zu erzeugen, die unterschiedliche Gewebeverteilung, subzelluläre Lokalisierung und Funktionen aufweisen können22. In anderen Modellorganismen scheint AMPK unter Standardwachstumsbedingungen auf zellulärer Ebene nicht essentiell zu sein, obwohl seine Inaktivierung zu embryonaler Letalität oder einem Entwicklungsstillstand führen könnte29,30. Im Gegensatz dazu ist AMPK in T. gondii essentiell, wie die schweren Wachstumsdefekte der AMPKγ-Deletionsmutante und der AMPKα-Deletionsmutante zeigen (Abb. 2 und Abb. S1). Dies verdeutlicht die Unterschiede in der AMPK-Funktion zwischen Toxoplasma-Parasiten und anderen Organismen. Unter den Eukaryoten, deren Genome sequenziert wurden, verfügt die überwiegende Mehrheit über Gene, die für AMPK kodieren. Es gibt jedoch einige Ausnahmen und Malariaparasiten bei Menschen und Nagetieren wie Plasmodium falciparum und Plasmodium berghei sind Beispiele. Andererseits kodieren Plasmodium-Arten eine Kinase namens KIN, die eine begrenzte Sequenzähnlichkeit zu AMPKα31 aufweist. Die phosphomimetische Mutante von KIN ist in der Lage, die Snf1-Deletionsmutante in Hefe zu retten, was auf eine funktionelle Konservierung dieser Proteine ​​hinweist. Obwohl Malariaparasiten offenbar kein kanonisches AMPKβ oder AMPKγ zu haben scheinen, reagieren sie außerdem auf Salicylat, das AMPKβ bindet und die AMPKα-Phosphorylierung fördert, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise kryptische AMPK-Untereinheiten haben, die von den kanonischen AMPKs abweichen31. Toxoplasma kodiert auch eine KIN, die der Plasmodium-KIN sehr ähnlich ist und deren Funktion noch geklärt werden muss. Der Phänotyp-Score (abgeleitet aus einem genomweiten CRISPR-Screening, bei dem die Fitnesskosten für die Inaktivierung eines bestimmten Gens geschätzt wurden) für TgKIN (0,04) impliziert, dass es für das Parasitenwachstum unter Standardbedingungen32 wahrscheinlich nicht erforderlich ist, ähnlich wie KIN bei Plasmodium sp.

Während des Lysezyklus von Toxoplasma-Tachyzoiten wird die AMPKα-Phosphorylierung am T221-Rest unmittelbar nach der Freisetzung der Parasiten aus den Wirtszellen stark erhöht. Die genauen Signale, die die Phosphorylierung auslösen, sowie die Kinasen, die die Phosphorylierung vermitteln, sind derzeit jedoch unbekannt. In Säugetierzellen führen verschiedene Bedingungen, die die Zellenergie (Abfall von ATP und Anstieg von AMP oder ADP) oder den Glukosespiegel abbauen, zur AMPKα-Phosphorylierung und -Aktivierung13,16,22. Unter diesen Bedingungen ist LKB1 die Hauptkinase, die für die AMPKα-Aktivierung verantwortlich ist33,34. Darüber hinaus kann AMPK auch durch Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase (CaMKK) als Reaktion auf erhöhtes zelluläres Ca2+ aktiviert werden 35,36. Durch Co-Reinigung mit SNF1-Untereinheiten wurden auch Kinasen identifiziert, die Hefe-SNF1 aktivieren37. Sowohl in Hefen als auch in Säugetierzellen sind mehrere Kinasen an der AMPK-Aktivierung beteiligt, die Homologie zwischen diesen Kinasen ist jedoch weitgehend auf die katalytischen Domänen beschränkt. Hefe-SNF1-Kinasen wie Tos3p können jedoch Säugetier-AMPK37 phosphorylieren. Ebenso können LKB1 und CaMKK in Hefen als Snf1-aktivierende Enzyme fungieren35,37. Diese Ergebnisse legen eine funktionelle Erhaltung der Kinasen nahe, die AMPK verschiedener Spezies phosphorylieren. Sequenzanalysen legten jedoch nahe, dass keine der Kinasen, die AMPKα im Menschen oder in Hefen phosphorylieren, in Toxoplasma Orthologe zu haben scheint. Andererseits ist es angesichts der Tatsache, dass die Phosphorylierung von TgAMPKα nach dem Austritt von Parasiten aus Wirtszellen induziert wird, vernünftig, vorherzusagen, dass CDPKs und AGC-Kinasen (Proteinkinase A-, G- und C-Familien) an der Phosphorylierung von TgAMPKα27 beteiligt sein könnten. 38,39,40. Zur Unterstützung wurden einige dieser Kinasen, darunter CDPK6, CDPK2A, PKG, CDPK1 und CDPK3, in den Co-IP-Experimenten als potenzielle AMPK-Interaktionspartner identifiziert (Ergänzungsdaten 1). Dennoch erfordern alle diese Möglichkeiten weitere Untersuchungen zur Bestätigung. Erwähnenswert ist auch, dass es möglicherweise mehr als eine Kinase gibt, die TgAMPKα aktiviert. T. gondii-Parasiten haben einen komplexen Lebenszyklus. TgAMPK kann in verschiedenen Entwicklungsstadien unterschiedliche Signale wahrnehmen und unterschiedliche Zellaktivitäten regulieren. Wir fanden heraus, dass bei Tachyzoiten die Freisetzung von Parasiten in die extrazelluläre Umgebung mit einer TgAMPK-Aktivierung einhergeht. Das genaue auslösende Signal ist derzeit jedoch nicht bekannt. Wir haben einige Möglichkeiten getestet, wie z. B. die Änderung der Na+- und K+-Konzentrationen, die intrazelluläre und extrazelluläre Pufferbedingungen nachahmen, sowie Änderungen des Ca2+-Spiegels (durch Verwendung des Calciumionophors A23187 oder des Chelators BAPTA-AM). Aber keines davon schien einen starken Einfluss auf die durch Austritt induzierte TgAMPK-Aktivierung zu haben. Daher sind weitere Arbeiten erforderlich, um das genaue Signal herauszufinden, das TgAMPK unter dieser Einstellung aktiviert.

Neben der Aktivierung durch Phosphorylierung spielt auch die subzelluläre Lokalisierung eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der AMPK-Aktivität. In höheren Eukaryoten pendelt AMPK auf Ran-GTPase-abhängige Weise zwischen Zellkern und Zytoplasma hin und her, und dieser Pendelverkehr kann durch Stress moduliert werden41. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Phosphorylierung und Aktivierung von Toxoplasma AMPK bei der Freisetzung intrazellulärer Parasiten in extrazelluläre Umgebungen drastisch zunahm. Daher haben wir unter diesen beiden Bedingungen auch die subzelluläre Lokalisierung von TgAMPK-Untereinheiten getestet. Unter Verwendung der Stämme AMPKα-mAID und AMPKγ-mAID, die einen HA-Tag an den C-Termini von endogenem AMPKα oder AMPKγ enthielten, zeigten IFA-Analysen, dass sich sowohl AMPKα als auch AMPKγ größtenteils im Zytoplasma intrazellulärer Parasiten befanden. Bei mechanisch freigesetzten extrazellulären Parasiten konnten jedoch bei 50 % bzw. 85 % der Parasiten nukleäre AMPKα und AMPKγ beobachtet werden (Abb. S11), was darauf hindeutet, dass der nukleozytoplasmatische Transport von AMPK ein weiterer Mechanismus zur Regulierung der AMPK-Aktivität während des Lysezyklus sein könnte von Tachyzoiten. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung identifizierten unsere Co-IP-Experimente Proteine, die am Kerntransport beteiligt sind, als potenzielle Bindungspartner von AMPK. Insbesondere wurden TGGT1_243960 und TGGT1_222380 in allen drei auf TgAMPK-Untereinheiten basierenden Co-IPs identifiziert (Tabelle S1). TGGT1_243960 enthält eine Kerntransportfaktor-2-Domäne (NTF2), die in Ran-Bindungsproteinen (Ras-verwandtes Kernprotein) konserviert ist, die am Transport von Makromolekülen zwischen Zytoplasma und Zellkern sowie am nukleozytoplasmatischen Transport von AMPK beteiligt sind. TGGT1_222380 ist ein Ortholog von Säugetier-Exportin 7 und es ist bekannt, dass Exportine den Kernexport von AMPK in höheren Eukaryoten vermitteln. Ob diese beiden Proteine ​​am nukleozytoplasmatischen Transport von AMPK in Toxoplasma-Parasiten beteiligt sind und welche physiologische Bedeutung ein solcher Transport hat, sind offene Fragen, die in Zukunft geklärt werden müssen. Darüber hinaus kommen AMPK-haltige Komplexe auch in anderen Organellen wie Lysosomen, Mitochondrien und dem endoplasmatischen Retikulum in höheren Eukaryoten vor26. Der lysosomale Komplex, der Aldolase, v-ATPase, Ragulator, Axin und LKB1 enthält, aktiviert AMPK während des Glukosemangels, bevor es zu einem ATP-Abfall kommt42. Zur Aktivierung der zytosolischen und mitochondrialen AMPK26-Pools sind stärkere Stoffwechselbelastungen erforderlich. Unsere Lokalisierungsergebnisse zeigten, dass sich Toxoplasma AMPK hauptsächlich im Zytoplasma befindet, die Möglichkeit einer Lokalisierung in anderen Organellen konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden. Obwohl Toxoplasma nicht für Ragulator und Axin zu kodieren scheint, wurde insbesondere festgestellt, dass Fructose-1-6-bisphosphat-Aldolase (ALD), die die Glucose-Erkennung durch den lysosomalen AMPK-Komplex vermittelt, auch ein potenzieller Interaktionspartner von TgAMPK ist (Ergänzende Daten 1). ). Ob der Parasit ALD einen Komplex mit AMPK bildet und eine ähnliche Glukose-Sensorfunktion hat, muss noch ermittelt werden.

In anderen Modellorganismen reguliert AMPK eine Vielzahl von Zielen, um die zelluläre Homöostase durch transkriptionelle und posttranslationale Modifikationsansätze zu kontrollieren. Die Liste der AMPK-Ziele wächst immer noch43. Aus unseren Ergebnissen der Überexpression verschiedener Allele von TgAMPKα in der TgAMPKγ-Depletionsmutante geht hervor, dass der Phosphorylierungsstatus von TgAMPKα an der T221-Position erhebliche Auswirkungen auf den Anabolismus und Katabolismus hat. Doch die zugrunde liegenden Mechanismen sind weitgehend unbekannt. Es ist auch nicht klar, ob die überexprimierte TgAMPKα in Abwesenheit von TgAMPKγ denselben Mechanismus zur Regulierung des Metabolismus und der Aktivitäten von Parasiten nutzte wie native TgAMPKα (wie die in Wildtyp-Parasiten) in Gegenwart von TgAMPKγ, da in anderen Modellorganismen die Aktivierung und Nachfolgende Aktivitäten von AMPK können durch unterschiedliche Ausmaße und Arten von Stress oder Stoffwechselschwankungen unterschiedlich moduliert werden44. Nichtsdestotrotz führt die TgAMPKγ-Depletion zu einem Wachstumsstopp, scheint jedoch keine dramatische Veränderung der Gentranskription zu verursachen. Andererseits wird die TgAMPKα-Phosphorylierung aufgehoben. In unserer Phospho-Proteomanalyse wurde die Häufigkeit von 285 einzigartigen Phosphopeptiden, entsprechend 170 Proteinen, nach der TgAMPKγ-Depletion signifikant verändert (P < 0,05, fache Änderung > 1,5). Dazu gehören viele Stoffwechselenzyme und Regulatoren wie Pyruvatkinase 1, Fructose-1,6-bisphosphat-Aldolase, Glucosetransporter GT1 und Pyruvatdehydrogenasekinase, die am Zuckerabbau und der ATP-Produktion beteiligt sind45,46,47 sowie eine Reihe von eukaryontische Initiationsfaktoren und CDP-Alkoholphosphatidyltransferase, die an der Synthese von Proteinen und Phospholipiden beteiligt sind. Viele dieser Proteine ​​wurden in den Co-IP-Experimenten auch als potenzielle Interaktionsproteine ​​mit AMPK identifiziert. Diese Proteine ​​sind mögliche Ziele von AMPK in Toxoplasma. Weitere Studien sind erforderlich, um zu untersuchen, wie genau sie durch AMPK reguliert werden und welche physiologische Bedeutung eine solche Regulierung hat. Andererseits wurden einige der in Abb. 7 aufgeführten unterschiedlich phosphorylierten Proteine ​​(wie GT1, ALD, PYK1 und ACS) im Detail analysiert, um festzustellen, ob die möglicherweise durch TgAMPK phosphorylierten Reste unter anderen Organismen konserviert waren. Interessanterweise sind Orthologe dieser Proteine ​​zwar in Modell-Eukaryoten von Hefen über Fruchtfliegen bis hin zum Menschen vorhanden, die darin enthaltenen phosphorylierten Reste sind jedoch entweder nicht konserviert oder weisen keine Hinweise auf eine AMPK-abhängige Phosphorylierung auf. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die analysierten Proteine ​​entweder keine direkten Substrate von TgAMPKα sind, sondern andere Kinasen, deren Aktivitäten durch TgAMPKα beeinflusst werden, oder dass die detaillierten Mechanismen, durch die Toxoplasma AMPK den Parasitenstoffwechsel reguliert, sich von denen anderer Eukaryoten unterscheiden.

Tachyzoiten der Stämme RH Δhxgprt3 und RH ∆hxgprt Tir127 und ihre Derivate wurden in menschlichen Vorhautfibroblasten (ATCC, USA) vermehrt, die in Dulbeccos' modifiziertem Eagles-Medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, USA), ergänzt mit 2 % fötalem Rind, kultiviert wurden Serum (FBS) (Gibco, USA), 2 mM Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin. Alle in dieser Studie verwendeten Stämme sind in Tabelle S2 in den Zusatzinformationen aufgeführt. Sofern nicht anders angegeben, wurden Parasiten durch sequenzielles Durchführen einer Spritze durch 22-Gauge-Nadeln aus den Wirtszellen gezwungen und vor der Verwendung durch Filtration durch 3-µm-Polycarbonatmembranen (Whatman, USA) gefiltert.

Um Orthologe des AMPK-Komplexes in Toxoplasma zu identifizieren, wurden Sequenzen von menschlichem (α2, β1 und γ2) AMPK und Hefe-SNF1 (Saccharomyces cerevisiae Snf1, Gal83 und Snf4) als Abfragesequenzen verwendet, um Protein-BLAST-Suchen gegen das Toxoplasma-Genom in ToxoDB durchzuführen (www .toxodb.org). Um TgAMPKα zu identifizieren, wurden Toxoplasma-Treffer aus menschlichen AMPKα2- und Hefe-Snf1-basierten BLAST-Suchen mit einem E-Wert unter 1e-50 als Abfragesequenzen für BLAST gegen das menschliche bzw. Saccharomyces cerevisiae-Genom verwendet. Nur die Treffer, die menschliches AMPKα und Hefe-Snf1 als Top-Treffer in den reziproken BLAST-Suchen identifizierten, wurden als mutmaßliche AMPKα-Untereinheiten in Toxoplasma akzeptiert. Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um TgAMPKβ und TgAMPKγ zu identifizieren, mit der Ausnahme, dass ursprüngliche Treffer (durchgeführt in ToxoDB unter Verwendung von menschlichem β1, γ2 und Hefe-Gal83, Snf4 als Köder) mit E-Werten unter 0,001 einer gegenseitigen BLAST-Suche in Mensch und Hefe unterzogen wurden.

Alle in dieser Studie verwendeten Plasmide sowie die Methoden zu ihrer Konstruktion sind in Tabelle S3 in den Zusatzinformationen aufgeführt. Alle verwendeten Primer wurden von einem kommerziellen Anbieter (Tsingke Biotechnology Co.,Ltd, Peking, China) synthetisiert und sind in Tabelle S4 aufgeführt. Alle Plasmide wurden durch Klonierung mehrerer Fragmente unter Verwendung des ClonExpress MultiS Cloning Kit (Vazyme Biotech, China) konstruiert, mit Ausnahme der locusspezifischen CRISPR-Plasmide, die durch Ersetzen der UPRT-zielenden gRNA-Sequenz in pSAG1-Cas9-U6-sgUPRT durch locus-spezifische Plasmide erzeugt wurden. spezifische Leitsequenzen gemäß den zuvor beschriebenen Protokollen48. Alle transgenen Stämme wurden durch CRISPR/Cas9-vermittelte ortsspezifische Genbearbeitung49 konstruiert. Der AMPKγ-mAID-Stamm wurde durch Co-Elektroporation des pSAG1::Cas9-U6::sg-AMPKγ-3UTR-Plasmids und des AMPKγ-mAID~HXGPRT konstruiert Fragment, abgeleitet vom Plasmid pUC19-AMPKγ-mAID~HXGPRT, in gereinigte Tachyzoiten des Stamms RH ∆hxgprt Tir1. Transfektanten wurden mit 25 µg/ml Mycophenolsäure (MPA) und 50 µg/ml Xanthin (Sigma-Aldrich, USA) ausgewählt und durch limitierende Verdünnung einzeln kloniert. Einzelne Klone wurden durch diagnostische PCRs (Primer sind in Tabelle S4 aufgeführt) und Immunfluoreszenztests (Nachweis des Vorhandenseins von HA-Tags) gescreent. Anschließend wurde eine Endkonzentration von 500 µM Indol-3-Essigsäure (IAA) (Sigma-Aldrich, USA) verwendet, um den Abbau von AMPKγ im AMPKγ-mAID-Stamm zu induzieren. Der AMPKα-mAID-Stamm wurde auf die gleiche Weise konstruiert. Der AMPKγ-Komplementationsstamm Comp-γ sowie die AMPKα-T221T-, -T221D- oder -T221A-exprimierenden Stämme wurden durch Co-Transfektion der AMPKγ- oder AMPKα-exprimierenden Kassetten und des auf pSAG1-Cas9-sgUPRT gerichteten UPRT in Tachyzoiten der AMPKγ konstruiert -mAID-Stamm. Transfektanten wurden mit 10 µM 5-Fluor-2'-desoxyruridin (FUDR) (Sigma-Aldrich, USA) und 1 µM Pyrimethamin (Sigma-Aldrich, USA) ausgewählt und einzelne Klone wurden vor der Verwendung durch diagnostische PCRs und IFA untersucht. Der Stamm RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-TY wurde durch Co-Transfektion von pSAG1:Cas9-sgAMPKα und dem aus pTUB1-Loxp-AMPKα-TY-LoxP-YFP-DHFR amplifizierten Loxp-AMPKα-TY enthaltenden Fragment in den Stamm RH Δhxgprt konstruiert und mit 1 µM Pyrimethamin selektiert. Arzneimittelresistente Transfektanten wurden durch limitierende Verdünnung einzeln kloniert. Der Stamm RH Δhxgprt/LoxP-AMPKβ-TY wurde auf sehr ähnliche Weise erzeugt. In beiden Fällen wurden einzelne Klone vor der Verwendung mittels diagnostischer PCR und IFA untersucht.

Frische Tachyzoiten der transgenen Stämme RH Δhxgprt/LoxP-AMPKα-TY, RH Δhxgprt/LoxP-AMPKβ-TY oder AMPKγ-mAID sowie der entsprechenden Elternstämme (RH Δhxgprt für AMPKα und AMPKβ, RH ∆hxgprt Tir1 für AMPKγ) die als Kontrollen dienten, wurden mit einer Nadel aus den Wirtszellen freigesetzt und durch Filtration durch 3 µm-Polycarbonatmembranen gereinigt. Dann wurden 5 × 108 Parasiten von jedem Stamm gesammelt, dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit 400 μl Western- und IP-Lysepuffer (Beyotime, Shanghai, China), der Phenylmethylsulfonylfluorid enthielt, lysiert. Während der Lyse wurden die Proben in ein Wasserbad-Ultraschallgerät gegeben und 30 Minuten lang in Eiswasser beschallt. Die Lysate wurden dann 10 Minuten lang bei 12.000 g zentrifugiert und die Überstände für nachfolgende Co-IP-Experimente gesammelt. Um Co-IP durchzuführen, wurden die Überstände der Parasitenlysate durch Inkubation mit Maus-IgG-konjugierten Protein-AG-Agarosekügelchen (Beyotime, Shanghai, China) bei 4 °C für 2 Stunden gereinigt, um Proteine ​​zu entfernen, die an Agarosekügelchen oder Maus-IgG binden . Die geklärten Überstände wurden dann zu Protein-AG-Agarosekügelchen gegeben, die mit Maus-Anti-Ty-Antikörpern oder Maus-Anti-HA-Antikörpern (Medical & Biological Laboratories CO., LTD, Tokio, Japan) konjugiert waren, und über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Anschließend wurden die Perlen durch 2-minütige Zentrifugation bei 1000 g pelletiert und dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen, um ungebundene Proteine ​​zu entfernen. Schließlich wurden die gebundenen Proteine ​​einem On-Bead-Trypsinverdau unterzogen und dann durch Massenspektrometrie identifiziert, wobei die unten in den Abschnitten LC-MS/MS und Datenanalyse beschriebenen Methoden zur Proteinidentifizierung befolgt wurden.

IFAs und Western Blots, die die Proteinexpression untersuchten, wurden gemäß etablierten Protokollen durchgeführt45,48. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Kaninchen-Anti-Toxoplasma-Aldolase (Verdünnung 1:5000 für WB und 1:2000 für IFA), Maus-Anti-Ty-Tag (der BB2-Klon von Anti-Ty1, bereitgestellt von Prof. David Sibley, Washington University in St. Louis, USA) (1:2000 für WB und 1:1000 für IFA), Maus-Anti-HA-Tag (der TANA2-Klon von Anti-HA, MBL International Corporation, Japan) (1:1000 für WB und 1:300 für IFA) , Maus-Anti-Toxoplasma SAG1 (bereitgestellt von Prof. David Sibley, Washington University in St. Louis, USA) (1:2000 für IFA), Maus-Anti-Toxoplasma GRA1 (1:5000 für WB), Kaninchen-Anti-Toxoplasma AMPKα (hergestellt durch Immunisierung). Kaninchen mit einem von AMPKα abgeleiteten Peptid (GSPKDPSRSPGRSE), konjugiert an Napfschnecken-Hämocyanin) (1:1000 für WB), Kaninchen-Anti-Phospho-AMPKα(Thr172) (Beyotime, China) (1:500 für WB), IRDye 680RD Ziegen-Anti-Kaninchen IgG (1:5000 für WB), IRDye 800CW Ziegen-Anti-Maus-IgG (LI-COR Biosciences. USA) (1:5000 für WB), HRP-markiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (Beyotime Biotechnology, China) (1:1000 für WB), Alexa Fluor 488 konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:2000 für IFA), Alexa Fluor 594 konjugiertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (1:2000 für IFA), Alexa Fluor 488 konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1: 2000 für IFA) und Alexa Fluor 594 konjugiertes Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (1:2000 für IFA) (Fisher Scientific. USA). IFA-Bilder wurden mit einem Olympus BX53-Mikroskop (Olympus Life Science, Japan) aufgenommen, das mit einer Axiocam 503-Monokamera (Carl Zeiss Inc., Deutschland) und einer ZEN 2-Software (Blue Edition) (Carl Zeiss Inc., Deutschland) ausgestattet war. Western Blots wurden mit einem Amersham Typhoon 5 Imager (GE Healthcare, UK) gescannt. Unbeschnittene und unverarbeitete IFA- und Western-Blot-Bilder wurden in der Quelldatendatei sowie in den Zusatzinformationen bereitgestellt.

Plaque-Assays, die das Gesamtwachstum von Parasiten in HFF-Monoschichten abschätzen, zweifarbiger Invasionsassay, der die Invasionseffizienz von Parasiten in HFF-Zellen bestimmt, Motilitätsassay, der das Gleiten gereinigter Parasiten auf BSA-beschichteten Deckgläsern untersucht, sowie der intrazelluläre Replikationsassay die die Proliferationseffizienz in HFF-Zellen bestimmt, wurden gemäß zuvor beschriebenen Protokollen45,48,50 durchgeführt. Alle Tests wurden unabhängig voneinander zwei- oder dreimal wiederholt, jeweils mit drei biologischen Replikaten. Um den Einfluss von AMPK-Inhibitor und -Aktivator auf die Parasiteninvasion zu testen, wurden 20 μM A769662 (Aktivator) (Macklin Inc., Shanghai, China) oder 5 μM Verbindung C (Inhibitor) (MedChemExpress LLC, Shanghai, China) zur Behandlung von RH-Parasiten verwendet für 1 Stunde vor dem Verlassen. Anschließend wurden die Parasiten durch Nadelpassage freigesetzt, durch Filtration gereinigt und zur 20-minütigen Infektion von HFF-Zellen verwendet. Anschließend wurde ein Zweifarben-Färbeprotokoll verwendet, um die Invasionseffizienz zu bestimmen. Um die Auswirkungen der beiden Verbindungen auf die Parasitenreplikation zu testen, wurden 20 μM A769662 oder 5 μM Verbindung C zur Behandlung von MEF/AMPKα1-AMPKα2-Zellen (bereitgestellt von Dr. Chen-Song Zhang von der Universität Xiamen) verwendet, die 24 Jahre lang mit RH-Parasiten infiziert waren H. Dann wurde die Anzahl der Parasiten in jedem PV durch IFA bestimmt, wie zuvor beschrieben45.

Die zellulären ATP-Spiegel wurden mit einem kommerziellen ATP-Assay-Kit (Beyotime, China) untersucht, das den ATP-Spiegel durch Bestimmung der Intensität der Lumineszenz quantifiziert, die durch das ATP-abhängige Enzym Glühwürmchen-Luciferase erzeugt wird. Frisch geerntete Parasiten (5 × 106) wurden 30 Minuten lang in 100 μl Lysepuffer auf Eis lysiert und 5 Minuten lang bei 12.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde zur anschließenden Untersuchung gesammelt. Um die ATP-Werte nachzuweisen, wurden 100 μl jeder Probe oder seriell verdünnten ATP-Standardlösung (5 μM, 2,5 μM, 1,25 μM, 0,625 μM, 0,312 μM und 0,078 μM) mit 100 μl ATP-Nachweisarbeitslösung in undurchsichtigem 96- Well-Platten und das Biolumineszenzsignal in jedem Well wurden im Cytation5-Plattenlesegerät (Biotek, USA) bestimmt.

Die Raten der entstehenden Proteinsynthese bei Parasiten wurden nach einer zuvor beschriebenen Methode51 bewertet. Befallene Parasiten wurden 35 Stunden lang in DMEM mit oder ohne IAA gezüchtet. Anschließend wurden die Kulturen mit vorgewärmtem PBS gewaschen und 30 Minuten in methioninfreiem DMEM-Medium kultiviert. Anschließend wurden 100 μM L-Homopropargylglycin (APExBIO, USA) zugegeben und 6 Stunden lang inkubiert. Nach der Behandlung wurden die Kulturen geerntet und die Parasiten mit einer Nadel aus den Wirtszellen freigesetzt, 15 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, 10 Minuten lang mit 0,1 % Triton X-100 permeabilisiert und 30 Minuten lang mit 10 % fötalem Rinderserum blockiert. und mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Proben in der CuAAC-Reaktionslösung (200 μM TBTA, 400 μM TECP, 200 μM CuSO4) resuspendiert. Anschließend wurden 10 μM FAM-Azid-5-Isomer (APExBIO, USA) zu jeder Probe gegeben und über Nacht bei 4 ° C unter Schütteln inkubiert. Die Parasiten wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 12.000 × g gesammelt, 20 Minuten im Dunkeln mit Hoechst (Beyotime, China) gefärbt, ausgiebig mit PBS gewaschen und schließlich in 300 μl PBS resuspendiert. Die Fluoreszenzintensität der Parasiten in jeder Probe wurde mit einem Cytoflex-LX-Durchflusszytometer (Backman, USA) analysiert, wobei für jede Probe > 10.000 Parasiten analysiert wurden. Jeder Stamm und Zustand wurde dreimal unabhängig getestet.

Intrazelluläre Parasiten des Stammes AMPKγ-mAID wurden vor dem Austritt 48 Stunden lang mit oder ohne IAA behandelt. Anschließend wurden die Parasiten durch Nadelpassage freigesetzt und durch Filtration gereinigt, um Wirtsreste zu entfernen. Anschließend wurde die Gesamt-RNA aus den Parasiten mit dem TransZol Up-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers (TransGen Biotech, China) extrahiert. Die Qualität der RNA-Proben wurde mit dem Agilent 2100 Bioanalyser (Agilent, USA) bewertet. Der Aufbau der Bibliothek erfolgte mit dem TruseqTM RNA Sample Prep Kit (Illumina, USA). Die RNA-Sequenzierung wurde auf einem HiSeq xten/NovaSeq 6000-Sequenziergerät (Illumina, USA) durchgeführt. Anschließend wurden die sauberen Lesevorgänge mithilfe der Hisat2-Software (HISAT2 (daehwankimlab.github.io)) auf das Genom des GT1-Stammes abgebildet. Die Expression von Genen wurde anhand der Werte der Transkripte pro Million Lesevorgänge (TPM) durch RSEM v1.3.1 (//deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/) profiliert, und differenziell exprimierte Gene wurden durch Vergleich ihrer TPM-Werte identifiziert DESeq2 v1.24.0 (http://bioconductor.org/packages/stats/bioc/DESeq2/). Gene mit einem p-Wert < 0,05 und einer Fold Change ≥ 2 (mit IAA vs. ohne IAA-Behandlung) wurden als differentiell exprimierte Gene behandelt. Das Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander wiederholt und die Rohdaten wurden in der SAR-Datenbank (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/) unter der Zugangsnummer PRJNA782309 hinterlegt.

Der AMPKγ-mAID-Stamm wurde 48 Stunden lang mit oder ohne IAA vorbehandelt, gefolgt von einer Nadelpassage, um Wirtszellen aufzubrechen und Parasiten freizusetzen. Anschließend wurden Tachyzoiten gesammelt, durch Filtration gereinigt und in 8 M Harnstoff (0,1 M Tris-Cl, pH 8,5) mit dem Protease-Inhibitor-Cocktail (Merk, USA) und dem Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Roche Applied Science, Deutschland) lysiert. Für jeden Stamm und jede Bedingung wurden unabhängig voneinander drei Proben hergestellt. Das Lysat wurde mit Ultraschall behandelt und 15 Minuten lang bei 4 °C zentrifugiert, um den Überstand zur Bestimmung der Proteinkonzentration mithilfe des BCA-Assays (Thermo Scientific, USA) zu sammeln. Anschließend wurden 500 μg Protein jeder Probe zum Aufschluss verwendet. TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphin, Endkonzentration beträgt 5 mM) (Thermo Scientific, USA) und Iodacetamid (Endkonzentration beträgt 10 mM) (Sigma-Aldrich, USA) zur Reduktion und Alkylierung wurden zu Proteinproben gegeben und bei inkubiert Raumtemperatur für jeweils 30 Min. Die Proteinmischung wurde viermal verdünnt (um die Harnstoffkonzentration auf 2 M zu reduzieren) und bei 37 °C mit Lys-C im Verhältnis 1:100 (Gew./Gew.) (Wako, Japan) 2 Stunden lang und dann mit Trypsin verdaut um 1:50 (w/w) (Promega, USA) über Nacht. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe von Ameisensäure auf einen pH-Wert <2 gestoppt.

Aufgeschlossene Proben wurden mit einer SepPak tC18 3cc Vac-Kartusche (Waters Corporation, USA) entsalzt und durch Lyophilisierung getrocknet. Anschließend wurden die Proben in 100 mM HEPES (pH = 8,0) aufgelöst und die Peptidkonzentration mit dem Quantitative Colorimetric Peptide Assay (Thermo Scientific, USA) gemessen. 100 μg Peptid jeder Probe (insgesamt sechs Proben, drei mit IAA-Behandlung und drei ohne) wurden unter Verwendung des Six-Plex-TMT-Kits (Thermo Scientific, USA) gemäß der Anleitung des Herstellers markiert. Die Effizienz der Probenmarkierung jedes Kanals wurde wie zuvor beschrieben überprüft52. Die Markierungsreaktion wurde durch Hydroxylamin gelöscht und dann wie oben beschrieben mit der tC18 Vac-Kartusche entsalzt.

Nach der TMT-Markierung wurden alle Peptide aus den sechs Proben gemischt (insgesamt 600 μg) und 30 μg für die Proteomanalyse verwendet. Die Proben wurden einer Umkehrphasen-Peptidfraktionierung mit hohem pH-Wert unterzogen (Pierce, USA) und 13 Fraktionen wurden für LC-MS-Analysen erfasst. Der Rest der markierten Peptide (insgesamt 570 μg) wurde zur Phosphopeptidanreicherung mithilfe eines SMOAC-Workflows verwendet, der Phosphopeptide nacheinander mit TiO2 und IMAC (Thermo Scientific, USA) anreicherte.

Für die Proteomanalyse wurden die 13 Fraktionen mit einer selbstgebauten 30 cm langen Analysesäule mit gezogener Spitze (100 μm ID x 360 μm OD, ReproSil-Pur C18-AQ 1,9 μm Harz, Dr. Maisch GmbH, Deutschland) analysiert. Die Säule wurde dann in eine Linie mit einem Easy-nLC 1200 nano HPLC (Thermo Scientific, USA) gestellt, das mit dem Massenspektrometer verbunden war. Die Temperatur der analytischen Säule wurde während der Experimente auf 55 °C eingestellt. Ein binäres Puffersystem (Puffer A: 0,1 % Ameisensäure in Wasser; Puffer B: 0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril) mit einem 180-minütigen Gradienten (5–10 % Puffer B über 1 Minute; 10–40 % Puffer B über 145 Minuten; 40–60 % Puffer B über 20 Minuten; 60–100 % Puffer B über 1 Minute; 100 % B für 13 Minuten). MS-Daten wurden mit einem Q-Exactive-Massenspektrometer (Thermo Scientific, USA) in einer datenabhängigen Top-20-Methode mit einer maximalen Injektionszeit von 50 ms, einem Scanbereich von 300–1800 m/z und einem AGC-Ziel von erfasst 3 × e6. MS/MS wurde mittels Kollisionsdissoziationsfragmentierung mit höherer Energie mit einem Zielwert von 1 × e5 und einer maximalen Injektionszeit von 100 ms durchgeführt. Vollständige MS- und MS/MS-Scans wurden mit einer Auflösung von 70.000 bzw. 17.500 erfasst. Der dynamische Ausschluss wurde auf 30 s festgelegt. Die mit jeder der Toxoplasma-AMPK-Untereinheiten gemeinsam ausgefällten Proteine ​​wurden mit dem gleichen LC-MS/MS-Ansatz identifiziert, der in diesem Abschnitt beschrieben wird.

Für die Phosphopeptidanalyse wurde jede angereicherte Peptidprobe in zwei Teile geteilt. Eine Hälfte wurde in einer zweidimensionalen Online-LC-Trennung namens MudPIT (Multidimensional Protein Identification Technology) verwendet, wie zuvor beschrieben53. Die andere Hälfte wurde auf eine einzelne Umkehrphasensäule mit zwei technischen Replikaten geladen. Für den MudPIT wurden angereicherte Peptide auf eine zweiphasige Pulled-Tip-Säule (75 μm Innendurchmesser x 360 μm Außendurchmesser) geladen, die mit 20 cm C18-Harz (ReproSil-Pur C18-AQ 1,9 μm Harz, Dr. Maisch GmbH, Deutschland) gefüllt war. gefolgt von 5 cm SCX-Harz (5 μm, Phenomenex, USA). Die Säule wurde dann zur massenspektrometrischen Analyse in eine Linie mit einem Easy-nLC 1200 nano HPLC (Thermo Scientific, USA) gestellt. Peptide wurden automatisch in die SCX-Phase der zweiphasigen Säule injiziert und ungebundene Peptide wurden mit der analytischen C18-Säule analysiert. Dann wurden die SCX-gebundenen Peptide nacheinander mit 5 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 50 %, 100 % 500 mM Ammoniumacetat eluiert. Jede Fraktion wurde mit der Umkehrphasensäule mit einem 120-minütigen Gradienten analysiert (Puffer A: 0,1 % Ameisensäure in Wasser; Puffer B: 0,1 % Ameisensäure in 80 % Acetonitril): 5–35 % Puffer B über 95 Minuten; 35–60 % Puffer B über 10 Min.; 60–100 % Puffer B über 2 Min.; 100 % Puffer B über (13 Min.). MS-Daten wurden mit einem Q-Exactive-Massenspektrometer (Thermo Scientific, USA) in einer datenabhängigen Top-20-Methode mit einer maximalen Injektionszeit von 50 ms, einem Scanbereich von 300–1800 m/z und einem AGC-Ziel von erfasst 3 × e6. MS/MS wurde mittels Kollisionsdissoziationsfragmentierung bei höherer Energie mit einem Zielwert von 5 × e5 und einer maximalen Injektionszeit von 100 ms durchgeführt. Vollständige MS- und MS/MS-Scans wurden mit einer Auflösung von 70.000 bzw. 17.500 erfasst. Der dynamische Ausschluss wurde auf 30 s festgelegt. Für die einzelnen Umkehrphasenanalysen war die MS-Methode dieselbe wie die MudPIT-Methode, mit Ausnahme eines 180-minütigen Gradienten (5–35 % Puffer B über 145 Minuten; 35–60 % Puffer B über 20 Minuten; 60–100 % Puffer B). über 2 Min.; 100 % Puffer B über 13 Min.) wurde laufen gelassen. Die in dieser Studie generierten Massenspektrometriedaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Identifikationsnummer PXD039148 beim ProteomeXchange-Konsortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) hinterlegt.

Die erfassten MS/MS-Daten wurden mit einer Toxoplasma gondii-Datenbank (ToxoDB.org) von Maxquant V1.6.10.43 unter Verwendung der Standardeinstellungen analysiert. Die Toleranz der Vorläufermasse und der Fragmentmasse wurde auf 20 ppm festgelegt. Die Haupttoleranz für Suchpeptide wurde entsprechend der Funktion des in der Studie verwendeten Instruments auf 4,5 ppm festgelegt. Als statische Modifikation wurde die Carbamidomethylierung von Cystein (+57,021 Da) festgelegt. Der Quantifizierungssuchtyp wählte das Reporterion ms2 unter Verwendung der TMT-6plex-Methode. Als variable Modifikationen für die proteomische Datenanalyse wurden die Oxidation von Methionin (+15,995 Da) und die Acetylierung des Protein-N-Terminus und für die phosphoproteomischen Daten die Phosphorylierung von Serin/Threonin/Tyrosin (+79,9663 Da) festgelegt. Trypsin wurde als Spaltungsenzym im vollspezifischen Modus definiert und die maximale fehlende Spaltung wurde auf 2 festgelegt. Der FDR der identifizierten Proteine ​​wurde auf 1 % festgelegt, was auf Peptidebene berechnet wurde.

Die Interpretation der proteomischen Ergebnisse von MaxQuant erfolgte in R4.0.0. Plattform (https://www.r-project.org/). Zur Datenaufbereitung wurde das Tidyverse-Paket (https://www.tidyverse.org/packages/) und das Limma-Paket (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html) verwendet um die Ausdrucksdaten anzupassen und die logarithmische Faltungsänderung und die p-Werte zu berechnen. Die Summe der Reporterintensitätswerte (berechnet von Maxquant) aller einzigartigen Peptide, die zu einem bestimmten Protein passen, wurde verwendet, um seine Häufigkeit in den Proben zu vergleichen. Proteine ​​mit log2 (Fachveränderung) ≥ 0,58 (Fachveränderung ≥ 1,5) und einem p-Wert ≤ 0,05 wurden als differenziell exprimiert betrachtet. Die Interpretation der phosphoproteomischen Ergebnisse erfolgte auf den Plattformen Python 3 (https://www.python.org/download/releases/3.0/) und Perseus (https://maxquant.net/perseus/). Das PaDuA-Paket in der Python 3-Umgebung wurde zur Datenbereinigung54, zur Zusammenfassung der Datenqualität und zur Visualisierung verwendet. Persues (v1.6) wurde verwendet, um ein lineares Motiv hinzuzufügen, und das preprocessCore-Paket wurde verwendet, um die Phosphopeptidintensität zu normalisieren55. Das Limma-Paket wurde verwendet, um die Ausdrucksdaten anzupassen und die logarithmische Faltungsänderung und die p-Werte zu berechnen. Die Häufigkeitsänderung jedes Phosphopeptids wurde durch den Fold Change (FC) der entsprechenden Proteine ​​normalisiert. Für Proteine, die eine signifikante Häufigkeitsänderung aufwiesen (Protein p ≤ 0,05), wurden die unterschiedlich phosphorylierten Peptide genannt, wenn der FC der Phosphorylierung/FC der Proteinhäufigkeit ≥ 1,5 und der Phosphopeptid-p-Wert ≤ 0,05 war. Für Proteine, die keine signifikante Häufigkeitsänderung aufwiesen (p > 0,05), wurden Phosphorylierungsstellen mit log2 (Phospho-Fold-Change) ≥ 0,58 und einem p-Wert ≤ 0,05 als unterschiedlich phosphoryliert angesehen.

Mit Ausnahme der transkriptomischen und proteomischen Daten wurden alle anderen Ergebnisse mit Prism 8 (GraphPad Software Inc., USA) analysiert. Die Stichprobengrößen wurden gemäß ähnlichen Experimenten ausgewählt, die in früheren Literaturstellen veröffentlicht wurden. Statistische Analysen wurden mit dem ungepaarten zweiseitigen Student-t-Test oder der zweiseitigen ANOVA mit Tukey-Mehrfachvergleichen nach den Tests durchgeführt, wie in den Legenden der Abbildungen angegeben. Alle IFA- oder Western-Blot-Ergebnisse wurden mindestens zweimal mit unabhängig vorbereiteten Proben wiederholt und es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Es wurden nur repräsentative Bilder gezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten RNA-Seq-Daten wurden in der SRA-Datenbank unter dem Zugangscode PRJNA782309 hinterlegt. Die in dieser Studie generierten phosphoproteomischen Daten wurden im ProteomeXchange-Konsortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) über das PRIDE-Partner-Repository mit der Identifikationsnummer PXD039148 hinterlegt. Alle weiteren Daten sind im Artikel bzw. den Zusatzinformationen dargestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Die Autoren danken Dr. Chen-Song Zhang für die Bereitstellung der MEF-Zellen ohne AMPKα1 und AMPKα2 sowie Prof. David Sibley (Washington University in St. Louis) und Dr. Nishith Gupta (Humboldt-Universität zu Berlin) für die kritische Lektüre das Manuskript. Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China finanziert (Zuschuss-Nr. 31961133032 und 31822054, beide an BS).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Zhipeng Niu, Jichao Yang, Xuke Yang.

Staatliches Schlüssellabor für landwirtschaftliche Mikrobiologie, Hochschule für Veterinärmedizin, Huazhong Agricultural University, Wuhan, Provinz Hubei, 430070, VR China

Yaqiong Li, Zhipeng Niu, Jichao Yang, Xuke Yang, Yukun Chen, Yingying Li, Xiaohan Liang, Jingwen Zhang, Fuqiang Fan und Bang Shen

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Ping Wu & Chao Peng

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Bang Shen

Hubei Hongshan Laboratory, Wuhan, Provinz Hubei, 430070, VR China

Bang Shen

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YL (Yaqiong Li), JY, XY und BS haben die Forschung entworfen; YL (Yaqiong Li), JY, ZN, YC, YL (Yingying Li), XL, JZ, FF und PW führten die Experimente durch; YL (Yaqiong Li), ZN, JY, XY, PW und CP analysierten die Daten; YL (Yaqiong Li), PW und BS haben den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Bang Shen.

Die Autoren erklären kein konkurrierendes Interesse.

: Nature Communications dankt Guillermo Alonso und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 5. Februar 2022

Angenommen: 12. Januar 2023

Veröffentlicht: 26. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36084-0

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